Nonstimulatory peptid MHC kompleksleri T hücrelerini aktive etmez ancak agonist peptid MHC T hücre yanıtlarını artırabilir. Bu protokol, insan CD8 T hücre aktivasyonu sırasında ko-agonizm araştırmak için deneysel bir sistem açıklar. MHC moleküllerini kovalent bağlı ağır zincir, beta-2-mikroglobulin ve peptid ile tek zincirli kompleksler olarak ifade ediyoruz.
Bu, önceden belirlenmiş peptidler sunan MHC moleküllerine mutasyonların girmesini sağlar. Bu protokol, hepatit B virüsü nün bir epitopu için özel olan insan CTN klonunu kullanır. Hepatite karşı T hücre yanıtları sırasında ko-agonizm mekanizmasının anlaşılması bu viral enfeksiyona karşı immünotropiklerin gelişmesine katkıda bulunabilir.
Sunulan yöntemler, bilinen peptid MHC özgüllüğü ile insan T hücre sistemlerinde T hücre aktivasyonunun araştırılmasında ve diğer temel yönlerinde kullanılabilir. Bu protokol, sinyal dizisi, ilgi peptidi, bağlayıcı, insan beta-2-mikroglobulin bağlayıcısı ve MHC ağır zincirden oluşan tek zincirli insan MHC sınıf I moleküllerini kullanır. Hepatit B'den gelen E1A3 peptid agonist peptid olarak kullanılır.
HIV gag nonstimulatory peptid olarak kullanılır. Tek zincirli insan MHC molekülleri tetrasiklin represörü içeren bir hamster hücre hattı ile ifade edilir. Agonist tek zincirli MHC tetrasiklin indüklenebilir plazmid kullanılarak ifade edilir, tetrasiklin yokluğunda çok düşük ekspresyon düzeyleri ile sonuçlanan, ve tetrasiklin varlığında yüksek ifade düzeyleri.
Agonist peptit MHC düşük düzeyde ifade CHO hücreleri kurucu olarak nonstimulatif peptid MHC ifade ile transfected. Bu deneysel sistemin kullanımı, t hücre yanıtlarının nonstimulator peptid MHC varlığında veya yokluğunda agonist peptid MHC ile karşılaştırılmasına olanak sağlar. Bu yordamı başlatmak için, metin protokolünde belirtildiği gibi, bir T-75 şişesinde CHO hücreleri yetiştirmek.
T hücre aktivasyon deneyinden bir gün önce, şişedeki hücreleri PBS ile yıkayın. PBS'de %05 tripsin ve %2 EDTA içeren bir çözelti ekleyin ve oda sıcaklığında beş ila on dakika kuluçkaya yatırın. Bir ışık mikroskobu kullanarak, hücreler müstakil olduğundan emin olmak için gözlemleyin.
Sonra trypsinization durdurmak için şişeye tam F12 ekleyin. Hücre süspansiyonuna 15 mililitrelik bir tüp aktarın. Beş dakika boyunca 400G'de santrifüj edin ve supernatant'ı pipetleme veya dekantasyon ile çıkarın.
Hücre peletini tam f12'nin beş mililitresinde yeniden askıya alın. Hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın ve CF12'de hücre konsantrasyonu mililitre başına 200.000 hücreye ayarlayın. Agonist sadece örneklere mililitre başına 50 ila 60 nanogram ekleyün ve yüksek miktarda agonist pMHC sınıf I ifadesini pozitif kontrol olarak ikna edin.
Bundan sonra, vortexing veya pipetleme ya DA CHO hücreleri karıştırın. U-alt 96-iyi plaka her kuyuya hücre süspansiyon 100 mikrolitre ekleyin. Bir gecede %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yat.
Deneyden bir gün önce, CTLS hücrelerini 400 kez G'de ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın ve sitokinveya PHA olmadan tam insan T hücre medyasında mililitre başına bir milyon hücre yoğunluğunda yeniden askıya. CTL'leri bir gecede %5 karbondioksitle 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Ertesi gün, T hücrelerini 400 kez G'de ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve tam serum içermeyen medya 2 mililitre hücreleri yeniden askıya. T hücrelerini saymak için bir hemositometre kullanın ve tam insan T hücre medyasında mililitre başına bir milyon canlı hücreye yoğunluklarını ayarlayın.
Bir ila 100 seyreltme anti-insan CD107a antikor ekleyin ve Brefeldin A bir ila 1000 seyreltme. Ardından, CHO hücrelerini içeren 96 kuyulu plakayı alın. Bir cam Pasteur pipet kullanarak, CHO hücrelerinden medya aspire.
Her kuyuya 200 mikrolitre T hücresi süspansiyonu ekleyin. 37 santigrat derecede CHO hücreleri ile T hücreleri ile co-kültür üç ila dört saat boyunca% 5 karbondioksit ile. Ortak kültürün sonunda, 96 kuyulu plakayı 400 kez G ve dört santigrat dereceyi beş dakika santrifüj edin.
Supernatant'ı azarlayarak veya hareket ettirerek çıkarın. Daha sonra her kuyuya, hücre yüzeyi antijen boyamaiçin, 50 mikrolitre DE 50 mikrolitre CD3 antikorları ve 2,5 mikrolitre CD3 antikorları ve 2,5 mikrolitre CD8 antikorları ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Örnekleri karanlıkta ve buzda 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Bundan sonra, örnekleri yıkamak için her kuyuya 150 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin. Örnekleri 400 kez G'de ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Supernatant'ı azarlayarak veya hareket ettirerek çıkarın.
Bir fiksasyon/permeabilizasyon kiti ayarlayın ve her kuyuya 100 mikrolitre fiksasyon/permeabilizasyon çözeltisi ekleyin ve karıştırmak için pipet ekleyin. 20 dakika boyunca buzda kuluçkaya yat. Sonra, plakayı 400 kez G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin.
Supernatant atın ve her kuyuya 1X perma/yıkama tampon200 mikrolitre ekleyin. Perma/yıkama tamponunu bir kez ekleyerek bu işlemi santrifüjden tekrarlayın. Bundan sonra, mililitre başına 3 mikrogram konsantrasyonda anti-interferon-gama içeren perm/yıkama tamponunun 50 mikrolitresi hücreleri yeniden askıya alın.
Karanlıkta 30 dakika boyunca buzda kuluçkaya yat. Daha sonra, 150 mikrolitre 1X perma/yıkama tamponu ekleyin. 400G'de santrifüj, dört santigrat derece, beş dakika lığına.
Supernatant çıkarın ve 1X perma / yıkama tampon 200 mikrolitre ekleyin. Plakayı tekrar 400 kez G, dört santigrat derece, beş dakika boyunca santrifüj edin ve aspirating veya flicking tarafından supernatant çıkarın. 200 mikrolitre yıkama tamponu yla numuneyi yeniden askıya alın ve sitometrik analize devam edin.
Deneyden bir gün önce, CHO hücrelerini girdap veya pipetleme ile karıştırın. Sonraki 12 kuyuplaka her kuyuya hücre süspansiyon bir mililitre ekleyin. Bir gecede %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yat.
Deneme günü, her kuyunun altından CHO hücrelerini ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Her kuyudan hücreleri içeren bir mililitre ortamı FACS tüplerine aktarın. Santrifüj 400 kez G ve dört santigrat derecede beş dakika.
Yıkama tamponunda seyreltilmiş 100 mikrolitre anti-HLA antikorda yeniden askıya alın. 30 dakika boyunca buzda kuluçkaya yat. Sonra her CHO örneğine bir mililitre yıkama tamponu ekleyin.
Santrifüj 400 kez G ve dört santigrat derecede beş dakika, ve supernatant atın. Her numuneyi 3 mililitre yıkama tamponunda yeniden askıya alın ve sitometri analizine devam edin. Bu çalışmada, insan CD8 pozitif T hücre aktivasyonu sırasında moleküler etkileşimin araştırılması için sağlam bir araç sunulmuştur.
Co-agonist pMHC varlığında veya yokluğunda düşük agonist pMHC düzeyleri sunan bir mühendislik ksizjenik sistem oluşturulur. Bu mühendislik ADC'ler daha sonra bir E183-özel insan CD8 pozitif T hücre klon uyarmak için kullanılır. Transfekslenmemiş CHO hücreleri ve imtimülatör olmayan tek zincirli Gag-MHC kompleksini ifade eden CHO hücreleri aktivasyonu tetiklemez.
Pozitif kontrol olan agonist tek zincirli E183-MHC kompleksinin yüksek seviyelerinin ekspresyonu, çok verimli interferon-gama üretimini ve degranülasyonu tetikleyerek, tek zincirli E183 yapısının T hücre efektör fonksiyonlarını etkinleştirmek için belirli bir TCR tarafından tanınabileceğini gösterir. Tek zincirli E183-MHC kompleksinin düşük seviyelerinin ekspresyonu, imtial olmayan bir Gag-MHC kompleksinin varlığıyla geliştirilmiş olan interferon-gama üretimi ve degranülasyonunun daha düşük seviyelerini tetikler. CD107a+T hücrelerinin çok yüksek yüzdelerinin, önceki çalışmalarla tutarlı olan düşük antijenik pMHC düzeylerine yanıt olarak bile gözlendiğini unutmayın.
Ancak, nonstimulatory Gag-MHC kompleksinin varlığı CD107a MFI artar. Bu işlem sırasında, nonstimulatan peptid ile veya olmadan eşit agonist sunum sağlamak için agonist peptit MHC ekspresyonunu kontrol etmek önemlidir. Her deneyde TCR benzeri antikorlar kullanılarak agonist peptit MHC ekspresyonunun ölçülmesi çok önemlidir.
Alternatif bir yaklaşım, antilüm dışı peptid MHC varlığında agonist peptit MHC sabit miktarda sunan desteklenen lipid bilayers veya boncuklar kullanmaktır. Bu deneysel sistem co-agonizm için birden fazla nonstimulatory peptid dizilerinin test izin vermelidir. Tek zincirli MHC teknolojisi, CD4 T hücre aktivasyonundaki moleküler etkileşimleri araştırmak ve klasik olmayan MHC moleküllerini araştırmak için kullanılabilir.
Bu protokolde insan kanı ve insan hücreleri kullanıyor. Kanyoluyla bulaşan hastalıkların bulaşma riskini azaltmak için insan kanı ile çalışırken gerekli tüm önlemleri alın.
