Bu video nasıl tip I kollajen ve iki boyutlu ve üç boyutlu kültür yöntemi kullanarak hücre kültürü yüzeylerin iki farklı türde hazırlamak için gösterir. Üç boyutlu kültür yöntemi biyolojik çevreye göre kabul edilir, üç boyutlu bir kültür alt tabakasının nasıl kolayca hazırlanacağını gösteren çalışmalar için yararlıdır. Çok sayıda hücre tiplerinde, aynı kollajen kullanılmasına rağmen, hücre davranışı önemli ölçüde iki boyutlu ve üç boyutlu substratlar arasında değişir.
Üç boyutlu kültür alt tabakası kullanılarak, canlı organizmalarınkine daha çok benzeyen hücre davranışı kolayca incelenebilir. Bu yöntem çok basittir ve en az özel reaktif gerektirir. Görsel gösteri önemlidir, çünkü bu yöntemin kolayca denendiğini göstermek isterken, üç boyutlu jel kırılgandır ve düzgün bir şekilde kullanmak çok önemlidir.
Başlamak için, uygun kültür ortamını hazırlayın. Kollajen hazırlamaya başlamak için, 10x PBS, deiyonize su, kollajen, 96-iyi kültür plakası ve buz üzerinde boş bir iki mililitrelik tüp yerleştirin. Bir pipet kullanarak, boş iki mililitrelik tüp için deiyonize su 1.12 mililitre ekleyin.
Deiyonize suya 200 mikrolitre 10x PBS ekleyin ve tüpü birkaç kez hafifçe sallayın. Hemen kullanımdan önce, iki mililitretüp kollajen 0.66 mililitre ekleyin. Yavaşça ve hızlı bir şekilde tüp birkaç kez sallamak.
96 kuyulu kültür plakasının her kuyuya bu kollajen çözeltisinin 100 mikrolitresini dökün ve kuyuların tüm yüzeyini kaplayın. Soldan sağa hareketi kullanarak plakayı hafifçe sallayın. Kültür plakasını bir saat boyunca 37 derecede karbondioksit kuvözde kuluçkaya yatırın.
Sonra kollajen jelasyon onaylamak için plaka yatırın ve temiz bir tezgah için kültür plakası hareket ettirin. Yavaşça kuyunun duvar boyunca borulama tarafından jeller üzerine K110 150 mikrolitre dökün. Bir saat liğine 37 derecede karbondioksit kuvözde kuluçkaya yat.
Bundan sonra, temiz bir tezgah için kültür plakası taşıyın. Hücre kültüründen hemen önce, K110'u nazikçe atmak için bir pipet kullanın. İlk 1.5 mililitrelik tüp bir milimolar hidroklorik asit 1.2 mililitre kollajen dört mikrolitre eklemek için bir pipet kullanın, ve yavaşça karıştırın.
Yeni bir 96-well kültür plaka her kuyuiçine bu kollajen karışımı 100 mikrolitre dökün. Plakayı soldan sağa doğru hafifçe sallayın ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, kollajen çözeltisi atın.
Bir pipet kullanarak, her biri pbs ile iyi yıkayın. Kültür plakasının her kuyusuna 150 mikrolitre BSA ve PBS ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatın. Hücre kültüründen önce %1'lik BSA çözeltisini atın.
Başlamak için, FEPE1L-8 hücreleri ve K110, tripsin ve trippsin inhibitörü metin protokolünde belirtildiği gibi hazırlayın. Dikkatle kültür çanak orta çıkarın ve% 0.05 tripsin üç mililitre eklemek için bir pipet kullanın. Yemeği karbondioksit kuvöze geri yerleştirin ve 37 derecede 5 dakika kuluçkaya yatırın.
Daha sonra 10x büyütme de faz kontrast mikroskobu kullanarak kültür çanak yüzeyinden hücre dekolmanı kontrol edin. Tripsin inhibitörü üç mililitre ekleyin ve 15 mililitrelik bir santrifüj tüp içinde müstakil hücreleri toplamak için bir pipet kullanın. Santrifüj 200 kez g beş dakika için.
Bundan sonra, supernatant atın ve K110 10 mililitre pelet resuspend. Hücreleri saymak için 10x büyütme faz kontrast mikroskobu kullanın ve mililitre başına 50, 000 hücre yoğunluğu K110 ile hücreleri seyreltmek. Yavaşça iyi duvar boyunca borulama tarafından kültür plakaher kuyuiçine hücre süspansiyon 0.1 mililitre tohum.
Uygun süre için 37 santigrat derecede karbondioksit kuvözde kuluçkaya yat. İlk iki mililitretüp te1.3 mililitre k110 ile tetrazolyum tuz ve WST-8 130 mikrolitre karıştırın. Kültür plakasını temiz bir tezgaha taşıyın ve K110'u kuyulardan nazikçe atmak için bir pipet kullanın.
K110 ile yapışmayan ve yapışmayan hücreleri hafifçe yıkayın. Sonra her kuyuya WST-8 ile karıştırılmış 110 mikrolitre K110 ekleyin. Karbondioksit kuvözde iki saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat.
Bundan sonra, temiz bir tezgah için kültür plakası taşıyın. Her kuyudan 100 mikrolitre klimalı ortam toplayın ve 96 kuyulu yeni bir kültür plakasının kuyularına taşıyın. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, 450 nanometre olarak absorbans ölçmek ve canlı hücrelerin sayısını tahmin.
Hücre morfolojisi non-fibröz ve fibril formları burada gösterilmiştir gözlenmektedir. Culturing ilk iki saat içinde, hücreler yapışır ve kollajen her iki formları yayıldı. Fibrül formundaki hücreler sınırlı yayılma gösterirken, fibröz olmayan formdaki hücreler yayılmaya devam eder ve hücre sayıları artar.
FEPE1L-8 hücreleri tip I kollajenin lifsiz olmayan formunda ve işlenmemiş çanak yüzeylerinde çoğalmaya devam eder. Buna karşılık, hücreler fibril formunda çoğalmaz. Bu yordamı çalışırken, üç boyutlu jel çok kırılgan olduğunu hatırlamak önemlidir.
Bir çözüm veya ipuçları jelleri ile doğrudan temas olmadığından emin olmak için dikkatli olmalıdır. Bu yöntem çeşitli şekillerde değiştirilebilir. Örneğin, numunenin membran bileşenlerini karıştırmak için, bir hücre kültürü alt tabaka bir bodrum membran taklit yapabilirsiniz.
Birçok durumda, canlı lardaki hücre dışı matriksin işlevleri bilinmemektedir. Üç boyutlu kültür deki kültür hücrelerine göre, canlı bedene daha çok benzeyen hücre dışı matriks bileşeninin işlevini inceleyebilirsiniz. Üç boyutlu jel kültür teknikleri uygulayarak, bir etkili hücrelerde ilaçların konsantrasyonu test edebilirsiniz.
Bu protokol, kişinin amacına dayalı olarak, jelasyonlar sırasında diğer EGM bileşenleri veya büyüme faktörleri karıştırılarak karmaşık üç boyutlu kültür yüzeyleri geliştirmek için kullanılabilir.
