Protokolümüz, doğal dokuyu yakından etkileyen 3D biyo-mühendislik modeli sunar. Bu, potansiyel olarak nöroblastom tedavisi ve teşhisi için yeni terapötikler ve biyobelirteçler keşfetmek için kullanılabilir. Başlıca avantajı, partiden partiye tutarlılık sağlayan tekrarlanabilir bir teknik kullanarak tümör mikroçevresini incelemek için fizyolojik olarak daha ilgili deneysel koşullar yaratmasıdır.
İskele yöntemimiz ilk olarak, nöroblastom için yeni terapötikleri tanımlamak ve ikinci olarak, bireysel hasta yanıtını daha iyi tahmin etmek için hastadan türetilen hücreleri dahil etmek için kullanılabilir. Başlamak için, PBS'de depolanan iskeleyi laminer akış başlığına yerleştirin. İskeleyi köşeden nazikçe kaldırmak için steril cımbız kullanın ve fazla PBS'yi çıkarmak için yan duvara bastırın.
Ardından iskeleyi, parlak tabaka aşağı bakacak şekilde, yapışmayan 24 oyuklu bir plakanın kuyusunun ortasına yerleştirin. Plakayı hücre çizgisi, tohumlama yoğunluğu ve zaman noktalarının ayrıntılarıyla etiketleyin. Her seferinde bir tohumlama yoğunluğuna sahip hücrelerle çalışın ve kalan hücreleri kullanıma hazır olana kadar inkübatörde 37 santigrat derecede tutun.
İskeledeki hücre bağlantısı için, hücre süspansiyonunu iyice karıştırmak için steril uçlu bir P20 pipeti kullanın ve her bir iskelenin ortasına 20 mikrolitre ilgili hücre süspansiyonu ekleyin, böylece hücre süspansiyonunun kuyunun yan duvarında veya tabanında değil, iskelenin üstünde kalmasını sağlayın. Hücrelerin %5 karbondioksit ve %95 nemde 37 santigrat derecede üç ila beş saat bağlanmasına izin verin. İnkübasyonun sonunda, her bir oyuğa yavaşça bir mililitre önceden ısıtılmış büyüme ortamı eklemek için bir P1000 pipeti kullanın, iskelelerin yer değiştirmesini önleyin ve plakayı gece boyunca inkübe edin.
Hücreler iskele içinde çoğaldıkça büyüme ortamının renk değişiklikleri için başlangıçta her iki ila üç günde bir iskeleleri gözlemleyin. Harcanan ortamın bir mililitresini kuyudan çıkarmak ve atmak için yavaş modda 10 mililitrelik bir pipet tabancası kullanın. Deney için şartlandırılmış ortam kullanıldığında, biyolojik kopyaların kullanılmış ortamını 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın ve hücresel kalıntıları santrifüjleme yoluyla aşağı doğru peletleyin.
Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve tüpü eksi 80 santigrat derecede saklayın. Pipet tabancasını damlama moduna ayarladıktan sonra, iskelelere yavaşça iki mililitre önceden ısıtılmış büyüme ortamı ekleyin. İskele içeren plakayı inkübe edin ve gösterildiği gibi istenen büyüme periyodu boyunca taze ortamı doldurun.
Laminer akış başlığında, uygun hücre canlılığı tahlil reaktifini 0.2 mikrometrelik steril bir filtreden bir santrifüj tüpüne süzülerek sterilize edin. Steril çözeltiyi, tam büyüme ortamını ve steril PBS'yi su banyosunda 37 santigrat derecede önceden ısıtın. Steril cımbız kullanarak, analiz edilecek iskeleleri 24 oyuklu yeni bir plakaya aktarın ve plakayı ilgili tüm ayrıntılarla etiketleyin.
Her oyuğa 900 mikrolitre önceden ısıtılmış büyüme ortamı ekleyin. Daha sonra her bir oyuğa 100 mikrolitre steril hücre canlılığı reaktifi ekleyin. Negatif kontrol için, iskelesiz bir kuyuya 900 mikrolitre orta ve 100 mikrolitre steril hücre canlılığı reaktifi ekleyin.
Plakanın üzerindeki kapağı değiştirin ve seyreltilmiş hücre canlılığı reaktifini kuyu boyunca dağıtmak için plakayı yaklaşık üç dakika hafifçe sallayın. Plakayı 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ve% 95 nem ile inkübe edin. Plakayı inkübatörden çıkardıktan sonra, plakayı birkaç saniye hafifçe sallayın ve metin el yazmasında gösterildiği gibi üçlü kopyaları oluşturun.
100 mikrolitre inkübe edilmiş ortam ve reaktifi 24 oyuklu plakanın bir kuyusundan yarı saydam 96 oyuklu plakanın bir kuyucuğuna aktararak teknik üçlüleri oluşturun ve bu adımı bir kuyu için toplam üç kez gerçekleştirin. Hücre canlılığı reaktifini ışıktan korumak için 96 oyuklu plakayı alüminyum folyo ile örtün. Kalan 700 mikrolitre ortamı ve reaktifi 24 oyuklu plakadaki iskelelerden çıkarın ve atın.
Her iskeleyi bir mililitre steril PBS ile iki kez yıkayın. 570 ve 600 nanometrede absorbansı ölçmek için bir mikroplaka okuyucu kullanın ve üreticinin tavsiyelerine göre hücre canlılığı reaktiflerinin yüzde azalma yüzdesini hesaplayın. Uygun yazılımı kullanarak hücre canlılığı sonuçlarını istatistiksel olarak analiz edin.
Hata çubukları oluşturmak ve tahlil değişkenliğini belirtmek için biyolojik üçlü değerleri girin. Uygun biyoistatistiksel yazılımı kullanarak deneysel zaman dilimi boyunca hücre canlılığındaki değişiklikleri incelemek için tek yönlü bir varyans testi analizi gerçekleştirin. Metin metninde açıklandığı gibi, grafiklerdeki zaman noktaları arasındaki önemli farklılıkları belirtin.
İskelelerde yetiştirilen iki nöroblastom hücre dizisi olan KellyLuc ve IMR32'nin canlılığı değerlendirildi. Artan hücre yoğunluğu, hücre canlılığı reaktifinin zamanla daha fazla azalmasına neden oldu. İskelelerdeki hücre büyümesi, iskelelerden ekstrakte edilen DNA'nın miktarı belirlenerek dolaylı olarak ölçüldü ve numune başına hücre sayısı hesaplandı.
IMR32 hücreleri, zamanla artan büyüme, ardından KellyLuc hücreleri gösterdi. Hücrelerin büyüme morfolojisi ve yapı iskelesi üzerindeki dağılımı hematoksilen, eozin ve immünohistokimya boyaması ile görsel olarak değerlendirildi. KellyCis83 hücreleri daha hızlı büyüdü ve daha az invaziv Kelly hücre hattından daha hızlı büyüdü ve her iki iskele bileşimine daha derine sızdı.
Nano-hidroksiapatit üzerinde yetiştirilen IMR32, 14 gün boyunca büyük, yoğun paketlenmiş kümelerle zıt bir büyüme modeli gösterdi. Hücreye özgü özellikler immünohistokimya boyaması, ardından phalloidin ve DAPI boyaması ile izlendi ve kollajen-glikozaminoglikan iskelelerinde Kelly ve KellyCis83 hücrelerinde aktin bolluğu gözlendi. İn vitro hücresel aktivite değerlendirmesi için, salgılanan kromogranin A seviyeleri ölçüldü ve kollajen-glikozaminoglikan ve kollajen nano-hidroksiapatit iskelelerinde yetiştirilen hücreler, geleneksel 2D kültürdeki büyümeye kıyasla daha fazla kromogranin A üretti.
Kemoterapiye dirençli KellyCis83 hücre hattı, Kelly hücre hattından daha fazla kromogranin A salgıladı. Hücre bağlanmasından sonra, hücreler çeşitli terapötiklerle tedavi edilebilir. Bu, hücrelerin ilaçlara tepkisi için geleneksel 2D kültürden daha fizyolojik olarak daha ilgili sonuçlar sağlayacaktır.
Bu teknik, araştırmacıların, kanser hücrelerinin, terapötiklere veya diğer hücre tipleriyle etkileşimlere yanıttan tümör mikro çevresindeki bir uyarana nasıl davrandığını ve tepki verdiğini daha iyi keşfetmelerini sağlar.
