Bu yöntemler 3D ayarda bağışıklık hücre aracılı tümör hücre sitotoksisitesi ve invaziv davranış içine mekanistik anlayışlar sağlayabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, bu 3D küresel eş kültür modelinin daha sonraki denemeler için küresel oidlerin transferini gerektirmemesidir. Bu prosedürü gösteren Apsra Nasir, bölümümüzden bir doktora öğrencisi olacaktır.
Bir hücre kültürü başlık aseptik tekniği kullanarak küresel oluşturmak için kabarcıklar önlemek için özen bir 81 microwell kauçuk kalıp içine erimiş agarose 500 mikrolitre ekleyin. Agarose dikkatle 12 kuyu plaka bireysel kuyular içine agarose dökümleri dışarı pop kauçuk kalıp esnek olduğunda. Dökümleri dengelemek için her kuyuya %10 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş 2,5 mililitre hücre kültürü ortamı ekleyin ve plakayı bir saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.
Kuluçka sonunda ilk çevredeki hücre kültürü ortamı kaldırmak için plaka eğim, daha sonra tohumlama odasında ve dikkatle her hücre tohumlama odasına damla tümör hücre süspansiyon için hazırlanan 190 mikrolitre tohum. Hücre kültüründe 15 dakikalık bir kuluçka dan sonra kuluçka makinesi 2,5 mililitre orta döküm dışında ekleyin ve 48 saat boyunca kuvöz için plaka dönmek. Bir T-hücre co-kültür kurmak için uygun sayıda T-hücre kurmak için uygun sayıda T-hücre uygunsuz T-hücre kültürünün 190 mikrolitre, iyi başına orta kadar 12 iyi plaka agarose döküm çevreleyen hücre kültürü ortamının kaldırılmasına izin vermek için ilk döküm.
Daha sonra tohumlama odasında, küresel leri çıkarmadan herhangi bir küresel emişli olup olmadığını kontrol etmek için bir ışık mikroskobu kullanın ve her döküm üzerinde yaklaşık yarım santimetre p200 yüklü pipet tutarak dikkatle sheroidler ayrıştırma olmadan bir damla şeklinde dökümler üzerine T-hücreleri tohum. Tüm dökümler dikkatlice hücre kültürü kuluçka için plaka iade edildiğinde 15 dakika boyunca başka bir 48 saat kuluçka için her döküm dışında fetal sığır serum uymuş taze hücre kültürü orta eklemeden önce. Tip bir kollajen seyreltik stok kollajen mililitre başına üç miligram son çalışma konsantrasyonu ve 10X PBS 11 mikrolitre eklemek için tip bir kollajen seyreltik stok kollajen gömmek için, kollajen 100 mikrolitre başına bir molar sodyum hidroksit 1.2 mikrolitre ekleyin.
Bir saat boyunca buz üzerinde kollajen çözeltisi nötralize ettikten sonra, hücre kültürü orta çevreleyen ve her döküm içinde gösterildiği gibi kaldırın. Dikkatle bir damla moda her döküm nötralize kollajen bir karışımı ekleyin ve hemen kuluçka ek bir saat için plaka ters önce beş dakika boyunca hücre kültürü kuluçka için plaka döndü. Kuluçka sonunda biyogüvenlik başlık kadar plaka sağ tarafı yerleştirin ve yavaş yavaş her kuyunun yan aşağı taze bir hücre kültürü orta ekleyin.
Sonra 48 saat boyunca hücre kültürü kuluçka için plaka dönün. Gömülü 3D co-kültürlerin immünofloresan boyama için nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında bir gecede% 5.4 formalin küreseloidler de dahil olmak üzere her agarose döküm düzeltmek. Ertesi gün, agarose döküm çevreleyen formalin kaldırmak ve tek bir sıvı hareketi içinde tohumlama odalarından soyulmuş için dökümizin izin vermek için her kollajen matris köşesinde kavramak için şık ucu cımbız kullanın.
Sekiz iyi oda slayt tek bir kuyu içine her kollajen yama yerleştirin ve her iyi için% 0.5 octoxynol 250 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında bir saat sonra tıkanan çözelti250 mikrolitre ile octoxynol değiştirin. Oda sıcaklığında bir saat sonra her kuyuya ilgi birincil antikor kokteyl 250 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında bir gecede koyu nemli bir odaya bir slayt yerleştirin.
Ertesi sabah her kuyudan birincil antikor çıkarın ve yıkama başına oda sıcaklığında beş dakika boyunca IF tampon 300 mikrolitre ile kuyuları üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, ışıktan korunan oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka için her kuyuya 250 mikrolitre uygunsuz ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Kuluçka sonunda antikor çıkarın ve gösterildiği gibi IF tampon ile her örnek üç kez yıkayın.
Son yıkamadan sonra numuneleri kuyu başına 300 mikrolitre PBS ile durula ve hazne deki slaytın duvarlarını dikkatlice çıkarın. Böylece sadece alttaki cam kaydırak kalır. Cam slayta 200 mikrolitre montaj ortamı ekleyin ve kabarcıkoluşturmadan kapak fişini dikkatlice numunenin üzerine bırakın sonra monte edilen numuneleri konfokal floresan mikroskobu ile görüntülemeden önce bir gecede karanlık kuru bir yerde saklayın Burada tahliller için tipik deneysel kurulumlar ve her protokol için deney sonunda temsili ve analiz edilebilir numuneler üretilebilir.
Bir agarose döküm mikro kuyular içinde tip bir kollajen 3D kültürü gömme iki birincil murine bu analiz J.In görüntü ile invazyon izleme ve analizi sağlar, pankreas kanser hücre hatları farklı küresel şekiller ve invaziv davranışlar gözlenmiştir. İlk hücre hattı bir tek hücre invazyoniçin gözlenen benzer daha kompakt bir küresel oluşumu ve dikenli invazyon gösterdi. İkinci hücre hattı daha gevşek ve kolektif bir istila paterni gösteren küresel oluşturdu.
Eş-kültür aynı anda tohumlu iki farklı tümör klonal hücre hatları ile veya tümör ve T-hücreleri tümör sferoid oluşumu veya sonraki tümör T-hücre etkileşimdeğerlendirmeleri üzerine yapılabilir. İnvaziv davranış immünüoresan boyama ve con fokal görüntüleme ayrıntılı bir değerlendirme için yüksek iş lenme şekilde yapılabilir. Agarose döküm tümör ve T-hücreleri arasındaki mekansal ilişkiyi ölçmek için seri kesit ve immünohistokimya boyama için parafin tüm 3D kültür sisteminin gömme sağlar.
Örneğin, T-hücre infiltrasyonu tanımlanabilir ve hücre yüzey marker boyama ile karakterize. Bu teknik, tümör hücresi T-hücre etkileşimlerini araştırmak için hasta örneklerinin analizinin yanı sıra uyarıcı ve bloke edici ilaçların kullanılmasını sağlar.
