Bu protokol bize beta hücreleri gibi insan dokularında endojen mitophagi kompleksleri izlemek için izin verir, önemli çeviri ile ilgili dokularda mitophagy araştırma kolaylaştırmak. Bu tekniğin bir avantajı nadir bir kullanılabilirlik veya küçük örnek numaraları ile dokularda vivo önemli mitophagy kompleksleri görselleştirmek için yeteneğidir. Standart protokollere göre izolasyon sonra, kültür 4-6 kez 10 üçüncü insan adacık eşdeğerleri tam pankreas adacık orta 10 mililitre en az bir gün için 37 santigrat derece.
Ertesi gün, kültür içinde tek tek insan adacıkları saymak için üç kat büyütme bir diseksiyon ışık mikroskobu kullanın. 1,5 mililitrelik adacık tüpüne tedavi başına 40 adacık veya ilgi durumu seçin. Adacıkları santrifüj ile tortulandırın ve 50 mikromolar PR619 ile desteklenen bir mililitre PBS'de peleti yeniden askıya alın.
Tüp ters ve taze PBS artı deubiquitinaz inhibitörü ikinci bir yıkama için santrifüj tarafından adacıkları toplamak. İkinci santrifüjden sonra, adacıkları 125 mikrolitre 0,25 tripsin artı inhibitörle 37 derecede üç dakika boyunca periyodik olarak nazik pipetleme ile tek hücrelere ayırın. Kuluçka sonunda, 37 derece santigrat bir mililitre ile reaksiyon tutuklama PR619 ile desteklenen pankreas adacık orta ısıtılmış.
Taze PBS artı yıkama başına inhibitör iki yıkar için santrifüj tarafından adacıkları toplayın. İkinci yıkamadan sonra, taze PBS artı inhibitör 150 mikrolitre ayrıştırılmış adacıklar resuspend. Bireysel adacıkların yapışması ve fiksasyonu için, hücre çözeltisini buzlu yüklü mikroskop slaytlarına sitedin ve hücresel alanı hidrofobik kalemle ana hatlayın.
Daha sonra oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ve PBS ile kuşatılmış hücreleri düzeltin. Adacık örneklerinin immünohistokimyasal analizi için hücreleri PBS'de iki beş dakikalık yıkama ile oda sıcaklığında yıkayın ve ardından %10 eşek serumu ve PBS ile spesifik olmayan bağlama engellemesi ve %0,3 deterjan oda sıcaklığında bir saat boyunca. Engelleme kuluçka sonunda, ubikitin özgü peptidaz karşı birincil fare antikor ile hücreleri coincubate 8, neuregulin reseptör yıkım protein-1 karşı birincil tavşan antikor, ve fare veya tavşan yükseltilmiş değildi beta hücre tanımlaması için özel bir marker böylece dört derece santigrat gecede yakınlık ligasyon test sinyali ile müdahale değil.
Ertesi sabah, bir rocker üzerinde PBS iki beş dakikalık yıkar ile örnekleri yıkayın. Taze hazırlanmış yakınlık ligasyon hesaplama çözeltisine anti-keçi Cy5 ikincil antikor ekleyin. İkinci yıkamadan sonra, her adacık örneğini 20 mikrolitre prob çözeltisi ile etiketlendirin ve slaytları 37 santigrat derecede bir saatlik kuluçka için plastik filmle geri alın.
Kuluçka sonunda, 37 santigrat derece bir 30 dakikalık kuluçka için slayt başına ligaz mikrolitre başına 0,25 adet ile takviye taze hazırlanmış ligasyon çözeltisi 20 mikrolitre ile kuluçka takip bir rocker üzerinde tampon A iki beş dakikalık yıkar ile hücreleri yıkayın. Ligasyonun sonunda, hücreleri yıkama başına iki dakika arabellek A ile iki kez yıkayın. Her numuneyi 37 santigrat derecede 100 ila 120 dakikalık bir kuluçka için polimeraz ile desteklenen 20 mikrolitre amplifikasyon çözeltisi ile kaplayın.
Hücreleri görüntülemeye hazırlamak için, numuneleri taze tampon A'da iki kez bir rocker üzerinde yıkama başına 10 dakika yıkayın ve ardından 0,1x tampon B'de iki dakika boyunca bir yıkama. Son yıkamadan sonra, dapi içeren montaj ortamı bir damla ile slaytlar monte ve dikkatlice herhangi bir kabarcıklar dışarı basın için bir neşter kullanarak her örnek üzerinde bir coverslip yerleştirin. Sonra kenarlarında net oje ile kapakları mühür.
Örnekleri görüntülemek için, birden çok odak düzlemini yakalayabilen bir mikroskopun sahnesine bir slayt yerleştirin ve 100 kez büyütmeyi seçin. Z-stack yüksekliğini yaklaşık 0,45 mikrometreye ve uygun leke, karşı leke ve canlı hücre sinyal uyarma ve emisyon parametrelerine ayarlayın. En az dokuz farklı odak düzlemi görüntüsü elde edin.
Floresan görüntü arka plan sinyallerinin ve başıboş ışığın en aza indirilmesini sağlamak için, tercih edilen standart bir görüntü işleme yazılımı kullanarak iki boyutlu deconvolution en yakın komşu algoritması kullanarak görüntüleri işleyin. Yakınlık ligasyon testi etkileşimlerini ölçmek için ImageJ'i açın ve yakınlık ligasyon testi görüntüsünü açın. İlk keskin odak lama görüntüsünden başlayarak Görüntü'ye tıklayın ve Ayarla ve Eşik'i seçin.
Spesifik olmayan yakınlık ligasyon tahlil sinyalini kaldırmak için eşiği ayarlayın ve analiz boyunca sinyali tutarlı tutmaya çalışmak için eşik ayarı notunu yapın. İşlem'i tıklatın ve İkili'yi seçin ve İkili'yi Yapın. Boyutun sıfırdan sonsuza kadar ayarlandığını, Daireselliğin sıfırdan bire ayarlı olduğunu, Göster'in Anahatlara ayarlı olduğunu ve Ekran sonuçlarını ve netsonuçları kutularını denetlediğini doğrulayın.
Örnek ve Z-yığın konumunu gösteren bir elektronik tabloda çözümlenen parçacıkların sayısını not edin. Ardından parçacıkları ölçmek için Parçacıkları Analiz Et ve Analiz Et'i tıklatın. Örnek için tüm odak içi Z-yığınları analiz edildiğinde, toplam etkileşim sayısını ölçmek için elektronik tablodaki örnek için toplam parçacık sayısını gönderin.
Yakınlık telinde kullanılan antikorlar ligandlara özgür ve herhangi bir çakışma göstermezler. Gözlemlendiği gibi, dağılım protokolü aşağı akım analizi için mikroskop alanında tek hücre elde etmede son derece etkilidir ve beta hücre boyama birincil insan adacıklarında yakınlık ligasyon tahlil boyama sonrasında korunur. Gösterilen teknikler kullanılarak, neuregulin reseptör yıkım protein-1 ve ubikitin spesifik peptidaz etkileşiminin palmitata 48 saatlik maruziyetsonrasında azaldığı saptanarak, diabetojenik uyaranları takiben önemli endojen mitophagi faktörlerinin değerlendirilmesi için bu talın fizibilitesinin vurgulandığı saptanabilir.
İnsan adacıklarının verimli ve nazik bir şekilde dağılması, doğru hücre popülasyonlarının aşağıya doğru sayısallaştırılmasını sağlamak için gereklidir. PLA, insan adacık örneklerindeki önemli mitophagi komplekslerinin değerlendirilmesine olanak sağlayarak diyabet araştırma alanını ileriye taşıyan mitophagy ve biyolojik olarak önemli insan hasta örneklerinin analizini sağlar.
