Este protocolo nos permite monitorear complejos de mitofagia endógenos en tejidos humanos como las células beta, facilitando la investigación mitáfagica en tejidos pivotales traslacionalmente relevantes. Una ventaja de esta técnica es su capacidad para visualizar complejos de mitofagia importantes in vivo en tejidos con una disponibilidad rara o en pequeños números de muestra. Después del aislamiento de acuerdo con los protocolos estándar, cultivo de cuatro a seis veces 10 a los terceros equivalentes de islotes humanos en 10 mililitros de medio de islot pancreático completo durante al menos un día a 37 grados centígrados.
Al día siguiente, utilice un microscopio de luz de disección con un aumento de tres veces para contar islotes humanos individuales dentro de la cultura. Escoja 40 islotes por tratamiento o condición de interés en tubos de 1,5 mililitros de medio de islotes. Sedimentar los islotes por centrifugación y resuspend el pellet en un mililitro de PBS complementado con 50 micromolares PR619.
Invierta el tubo y recoja los islotes por centrifugación para un segundo lavado en PBS fresco más inhibidor de la deubiquitina. Después de la segunda centrifugación, disociar los islotes en células individuales con 125 microlitros de 0.25%trypsin más inhibidor durante tres minutos a 37 grados Celsius con pipeteo suave periódico. Al final de la incubación, detenga la reacción con un mililitro de 37 grados Celsius calentado medio de islote pancreático complementado con PR619.
Recoger los islotes por centrifugación para dos lavados en PBS fresco más inhibidor por lavado. Después del segundo lavado, resuspender los islotes disociados en 150 microlitros de PBS fresco más inhibidor. Para la adherencia y fijación de los islotes individuales, citotraja la solución celular en diapositivas de microscopio cargadas congeladas y delinea el área celular con una pluma hidrófoba.
Luego fije las celdas rodeadas con 4%paraformaldehído y PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. Para el análisis inmunohistoquímico de las muestras de islotes, lave las células con dos lavados de cinco minutos en PBS a temperatura ambiente, seguido de un bloqueo de unión no específico con 10%suero de burro y PBS más 0.3% detergente durante una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación de bloqueo, coincubate las células con anticuerpos primarios de ratón contra peptidasa 8 específicas de la ubiquitina, anticuerpos primarios de conejo contra la proteína de degradación del receptor de neuregulina-1, y un marcador específico para la identificación de células beta que no se levantó en ratones o conejos para no interferir con la señal de ensayo de ligadura de proximidad durante la noche a cuatro grados centígrados.
A la mañana siguiente, lave las muestras con dos lavados de cinco minutos en PBS en un balancín. Añadir anticuerpo secundario anti-cabra Cy5 a una solución de ensayo de ligadura de proximidad recién preparada. Después del segundo lavado, etiquete cada muestra de islotes con 20 microlitros de solución de sonda y recupere los portaobjetos con película de plástico para una incubación de una hora a 37 grados centígrados.
Al final de la incubación, lave las células con dos lavados de cinco minutos en el tampón A en un balancín seguido de incubación con 20 microlitros de solución de ligadura recién preparada complementadas con 0,25 unidades por microlitro de ligasa por diapositiva para una incubación de 30 minutos a 37 grados centígrados. Al final de la ligadura, lave las células dos veces con el tampón A durante dos minutos por lavado. Cubra cada muestra con 20 microlitros de soluciones de amplificación complementados con polimerasa para una incubación de 100 a 120 minutos a 37 grados centígrados.
Para preparar las células para la toma de imágenes, lave las muestras dos veces en el tampón fresco A durante 10 minutos por lavado en un balancín seguido de un lavado en 0,1x tampón B durante dos minutos en el balancín. Después del último lavado, monte las diapositivas con una gota de medio de montaje que contenga DAPI y coloque cuidadosamente un cubreobjeto sobre cada muestra utilizando un bisturí para presionar cualquier burbuja. A continuación, selle los cubreobjetos con esmalte de uñas transparente alrededor de los bordes.
Para tomar una imagen de las muestras, coloque una diapositiva en el escenario de un microscopio capaz de capturar varios planos focales y seleccione el aumento de 100 veces. Establezca la altura de la pila Z en aproximadamente 0,45 micrómetros y los parámetros adecuados de excitación y emisión de la señal de la célula viva. Obtenga al menos nueve imágenes de plano focal diferentes.
Para asegurarse de que las señales de fondo de la imagen de fluorescencia y la luz perdida se minimicen, procese las imágenes utilizando un algoritmo de vecino más cercano de desconvolución bidimensional utilizando un software de procesamiento de imágenes estándar de elección. Para cuantificar las interacciones de ensayo de ligadura de proximidad, abra ImageJ y abra la imagen de ensayo de ligadura de proximidad. A partir de la primera imagen nítidamente enfocada, haga clic en Imagen y seleccione Ajustar y Umbral.
Ajuste el umbral para eliminar toda la señal de ensayo de ligadura de proximidad no específica y tome nota del ajuste de umbral para tratar de mantener la señal coherente durante todo el análisis. Haga clic en Procesar y seleccione Binario y Crear binario. Confirme que Tamaño está establecido en cero a infinito, Circularidad se establece en cero en uno, Mostrar se establece en Esquemas y marque los cuadros Mostrar resultados y Borrar resultados.
Observe el número de partículas analizadas en una hoja de cálculo que indica la muestra y la posición de la pila Z. A continuación, haga clic en Analizar y analizar partículas para medir las partículas. Cuando se hayan analizado todas las pilas Z enfocadas para la muestra, envíe el número total de partículas de la muestra en la hoja de cálculo para cuantificar el número total de interacciones.
Los anticuerpos utilizados en el ensayo de proximidad son específicos para los ligandos y no demuestran ninguna superposición. Como se ha observado, el protocolo de dispersión es altamente eficiente en la obtención de células individuales en el campo de visión del microscopio para el análisis posterior y la tinción de células beta se conserva después de la tinción de la ligadura de proximidad en los islotes humanos primarios. Utilizando las técnicas demostradas, se podría determinar que la interacción de la proteína de degradación del receptor de neuregulinina-1 y la ubiquitina-específica peptidasa 8 disminuye después de una exposición de 48 horas al palmitato, destacando la viabilidad de este ensayo para evaluar los factores clave de la mitofagia endógena después de los estímulos diabetogénicos.
La dispersión eficiente y suave de los islotes humanos es esencial para asegurar la cuantificación de las poblaciones celulares correctas aguas abajo. El PLA permite la evaluación de complejos de mitofagia importantes en muestras de islotes humanos que permiten el análisis de la mitofagia y muestras de pacientes humanos de importancia biológica que mueven el campo de la investigación de la diabetes hacia adelante.
