このプロトコルは、ベータ細胞などのヒト組織における内因性ミトファジー複合体を監視することを可能にし、極めて重要な翻訳関連組織におけるマイトファジー研究を促進する。この技術の1つの利点は、まれな可用性または少数のサンプル数で組織中の生体内の重要なマイトファジー複合体を視覚化する能力である。標準的なプロトコルに従って分離した後、培養は、完全な膵島培地の10ミリリットルで4〜6回10〜3番目のヒト膵島当量を摂氏37度で少なくとも1日培養する。
翌日、解剖用光顕微鏡を3倍の倍率で使用し、培養中の個々のヒト島を数える。1.5ミリリットルの小島培地のチューブに治療または関心のある条件ごとに40個の島を選びます。遠心分離によって小島を沈め、50マイクロモルPR619を補充したPBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁する。
チューブを反転し、新鮮なPBSプラスデュビキチナーゼ阻害剤で2回目の洗浄のための遠心分離によって島を収集します。第2遠心分離後、0.25%トリプシンと阻害剤の125マイクロリットルの125マイクロリットルを周期的に穏やかなピペッティングで摂氏37度で3分間、単一細胞に解約する。インキュベーションの終わりに、PR619を添加した37°Cの温かい膵島培地の1ミリリットルで反応を逮捕する。
新鮮なPBSと洗浄ごとに阻害剤で2回の洗浄のための遠心分離によって島を収集します。2回目の洗浄後、解約された小島を150マイクロリットルの新鮮なPBSプラスインヒビターで再懸濁する。個々の島の付着および固定のために、細胞溶液をフロストチャージされた顕微鏡スライドに、疎水性ペンで細胞領域の輪郭を描く。
その後、4%パラホルムアルデヒドとPBSで囲まれた細胞を室温で15分間固定します。この小水サンプルの免疫物質化学的分析では、PBSで5分間の洗浄を2回PBSで洗浄し、続いて10%ロバ血清とPBSに0.3%の洗剤を加えた非特異的結合遮断を室温で1時間洗浄します。ブロッキングインキュベーションの最後に、ユビキチン特異的ペプチダーゼ8に対する一次マウス抗体で細胞をコインキュベートし、ニューレグリン受容体分解タンパク質-1に対する一次ウサギ抗体、およびマウスまたはウサギで生じたβ細胞同定に特異的なマーカーを4°Cで一晩近接ライゲーションアッセイシグナルを妨げないようにする。
翌朝、ロッカーのPBSで2回の5分間の洗浄でサンプルを洗います。作製したばかりの近接ライゲーションアッセイ溶液に抗ヤギCy5二次抗体を加えます。2回目の洗浄後、各小藻サンプルに20マイクロリットルのプローブ溶液をラベル付けし、37°Cで1時間のインキュベーションのためにプラスチックフィルムでスライドを回収します。
インキュベーションの最後に、ロッカーのバッファAに5分間の洗浄を2回行い、続いて20マイクロリットルの準備されたライゲーション溶液をインキュベーションして、スライド当たり0.25単位のリガーゼあたり30分のインキュベーションを37°Cで洗浄します。ライゲーションの終了時に、細胞を1回の洗浄につき2分間、緩衝Aで2回洗浄する。各サンプルに20マイクロリットルの増幅液を取り付け、ポリメラーゼを補い、摂氏37度で100~120分のインキュベーションを行います。
細胞をイメージング用に準備するには、サンプルを新鮮なバッファAで1回、ロッカーで1回10分間洗浄し、その後0.1xバッファBで1回洗浄します。最後の洗浄後、DAPIを含む取り付け媒体の一滴でスライドを取り付け、慎重に任意の気泡を押し出すためにメスを使用して、各サンプルの上にカバースリップを置きます。その後、エッジの周りに明確なマニキュアでカバーリップを密封します。
サンプルを画像化するには、複数の焦点面をキャプチャできる顕微鏡のステージにスライドを置き、100倍の倍率を選択します。Zスタックの高さを約0.45マイクロメートルに設定し、適切な染色、カウンターステイン、および生細胞信号励起および発光パラメータを設定します。少なくとも9つの異なる焦点面画像を取得します。
蛍光画像の背景信号と浮遊光を最小限に抑えるために、選択した標準画像処理ソフトウェアを使用して、2次元デコンボリューションニアネイバーアルゴリズムを利用して画像を処理します。近接ライゲーションアッセイ相互作用を定量化するために、ImageJを開き、近接ライゲーションアッセイ画像を開く。最初の急激にフォーカスが合った画像から開始し、[イメージ] をクリックして[調整としきい値]を選択します。
しきい値を調整して非特異的近接ライゲーションアッセイシグナルをすべて除去し、解析中に信号の一貫性を保つためにしきい値調整をメモします。[処理] をクリックし、[バイナリ] と [バイナリを作成] を選択します。[サイズ] が 0 に設定されて無限大に、循環が 0 に設定されて 1 に設定され、[表示] が [アウトライン] に設定され、[結果の表示] および [結果のクリア] ボックスをオンにします。
サンプルと Z スタックの位置を示すスプレッドシートで分析されたパーティクルの数に注意してください。次に、[パーティクルの解析と解析] をクリックして、パーティクルを測定します。サンプルのすべてのフォーカス中 Z スタックを分析したら、サンプルの合計パーティクル数をスプレッドシートに送信して、相互作用の合計数を定量化します。
近接アッセイで使用される抗体はリガンドに特異的であり、重複を示すものではありません。観察されるように、分散プロトコルは下流分析のための顕微鏡視野で単一細胞を得る上で非常に効率的であり、β細胞染色は、一次ヒト小島における近接ライゲーションアッセイ染色後に保持される。実証された技術を用いて、ノイレグリン受容体分解タンパク質-1とユビキチン特異的ペプチダーゼ8の相互作用がパルミチントへの48時間の暴露後に減少し、糖尿病性刺激に続く主要な内因性個所因子を評価するためのこのアッセイの実現可能性を強調することができると判断することができる。
人間の小島の効率的で穏やかな分散は、下流の正しい細胞集団の定量化を確実にするために不可欠です。PLAは、ヒトの小地サンプル中の重要なマイトファジー複合体の評価を可能にし、糖尿病研究の分野を前進させるマイトファジーおよび生物学的に重要なヒト患者サンプルの分析を可能にする。
