Bu protokol, yerleşik glia doğrudan beyinde yeni nöronlar oluşturmak mümkün olduğunu gösterir ve bu yeniden programlanmış hücreler alt tip özgü nöronlara olgun. Ana avantajı, NG2-glia'nın özel hedeflemesini sağlayan cre-bağımlı AAV virüsü ve yeniden programlanmış nöronları analiz için etiketleyen GFP muhabiridir. Beyinde yeni nöronlar üreten beyinde hücre replasman tedavileri için gelecekteki gelişimine yol açabilir.
Protokolümüzde psikiyatrik bozukluklar alabilen parvalbumin-pozitif internöronlar üretiyoruz. In vivo reprogramming diğer beyin alanları ve devreleri ne nöronal fenotip ve nörolojik durum hedef istediğiniz bağlı olarak uygulanabilir. Prosedürü gösteren Jenny Johansson olacak: bir teknisyen, Maria Pereira: eski bir doktora öğrencisi, ve Marcella Birtele: bizim laboratuvarda bir doktora öğrencisi.
AAV5 viral vektör üretmek için, beş T175 şişelerinde standart kültür ortamına sahip TOHUM HEK293T hücreleri. Hücreler %50-70 birleştiğinde, transveksiyon için aşağıdaki karışımı hazırlayın. 50 mililitrelik bir santrifüj tüp, vektör plazmid eşit molar miktarda ekleyin, ve pDG serisi yardımcı plazmid.
144 mikrolitrelik son bir hacme Tris-EDTA tamponu ekleyin ve toplam 1296 mikrolitre lik bir hacim elde etmek için ultra saf su ekleyin ve karıştırın. Sonra, 2.5 molar kalsiyum klorür 144 mikrolitre ekleyin ve karıştırın. Bundan sonra, DNA çözeltisine 1.92 mililitre HBS ekleyin ve girdap hemen.
Tam olarak 60 saniye oda sıcaklığında kuluçka. Daha sonra, taze hücre kültürü orta ve karışımı 28 mililitre için çözüm aktarın. Şişedeki orta yı transveksiyon karışımı içeren ortamla değiştirin.
Üç gün bekleyin ve medyayı boşa harcayın. Her şişeye beş mililitre hasat tamponu ekleyin, sonra kalan hücreleri ve havuzu hücre çözeltisi ile durulamak için her şişeye dört mililitre DPBS ekleyin. Hasat edilen hücreleri 1,000 x g'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin.
Santrifüjden sonra, supernatant çıkarın ve lysis tampon 15 mililitre pelet eritin. Kuru buzüzerinde 50 mililitrelik santrifüj tüp dondurma kıtave eksi 20 derece santigrat dondurucuda saklayın. Kullanmadan önce, 37 santigrat derece bir su banyosunda hasat hücre lysate çözültün.
Bu işlemde, iodixanol gradyan ultrasantrifüj ultrasantrifüj ile AAV arıtma gerçekleştirmek ve oda sıcaklığında bir saat ve 45 dakika için 350, 000 x g santrifüj ile ultracentrifuge tavan tüpleri kullanın. AAV içeren fazı çıkarmak için, 10 mililitrelik bir şırınga ile 18 gauge iğneyi yaklaşık iki milimetre altında, 40-60%faz sınırının altında, yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve geri çekin. Viral vektör ün beş ila altı mililitre çıkarıldıktan sonra protein bandına ulaşmadan önce durduğunuzdan emin olun.
Daha sonra seyreltilmiş iyodixanol degradesini bir aniyon değişim filtresi nden geçirerek, saniyede bir damladan daha hızlı olmayan bir oranda iterek arındırın ve yoğunlaştırın. Daha sonra, yıkamak için filtre ile yavaş yavaş IE tampon üç mililitre itin. Daha sonra, bir santrifüj filtre ünitesi içine elüsyon tampon bir ila iki mililitre karışımı elute.
Aygıta dört mililitrelik son bir ses hacmine DPBS ekleyin. Filtrede 0,5 mililitreden az DPBS kalana kadar oda sıcaklığında 2, 000 x g'da santrifüj bırakılır. Daha sonra, tüpün altındaki sıvıyı çıkarın, dört mililitre DPBS ile doldurun ve tekrar santrifüj edin.
Bu adımı iki kez daha tekrarlayın, filtredeki konsantre vektörün hacminin son santrifüjden sonra yaklaşık 200 mikrolitre olduğundan emin olun. Bir pipet kullanarak 200 mikrolitre konsantre vektörü çıkarın ve sterilize etmek için 0,22 mikrometre filtreden geçirin. Sonra, aliquot 200 mikrolitre kilitli kesici uç ile cam bir şişe içine.
Yeniden programlama faktörleri enjekte etmek için, stereotaksik çerçeveye anestezili bir fare yerleştirin. Ameliyatın başında uygun analjezi uygulayın, sonra bregma hemen üzerinde enjeksiyon iğnesi cam kapiller ucugetirmek. Hem A-P hem de M-L düzlemlerinde kılcal ucun mükemmel bir şekilde düz olduğundan emin olun.
Dijital koordinat sayacında hem M-L hem de A-P değerlerini 0.0'a sıfırla. Hayvanın başının mükemmel bir şekilde düz bir konumda olduğundan emin olmak için, A-P kolu artı 2.0 ve eksi 2.0'da ve M-L kol artı 2.0 ve eksi 2.0 olduğunda D-V koordinat değerini ölçmek için dijital koordinat sayacını kullanın. Diş çubuğunun ve kulak çubuklarının yüksekliğini buna göre ayarlayın.
Daha sonra, şırıngayı hafifçe kaldırın ve enjeksiyon koordinatlarında bir diş matkabı kullanarak bir delik aç. Dairesel ve nazik bir şekilde çalışarak sahada sondaj yapmaya başlayın. Daha sonra, açık kesi üzerine pamuk gazlı bez bir parça yerleştirin ve tuzlu çözelti ile şırınga floş.
Kızarma sonra, bir hava kabarcığı ve viral vektör içeren çözelti bir mikrolitre çizin. Viral çözeltinin hava kabarcığı altında kolayca görüntülenediğinden emin olun. Daha sonra şırıngayı düşürün, istenilen derinliğe doğru yavaşça ilerleyin ve yörüngenin kemik parçalarından arındırdığından emin olun.
Daha sonra, dakikada 0,4 mikrolitre hızında viral çözeltinin bir mikrolitre enjekte. Enjeksiyon bittiğinde, şırınga çekilmesinden önce difüzyon için iki dakika bekleyin. Difüzyondan sonra, kılcal damarın ucu tamamen beyinden çekilene kadar şırıngayı yavaşça geri çekin, sonra kesiği dikkatlice dikin ve hayvanı stereotaksik çerçeveden çıkarın.
Bilinç geri kazanılına kadar postoperatif bir istasyonda hayvan izlemek. Hayvanlar, virüs enjeksiyonundan sonra 12 haftaya kadar tutularak yerleşik glianın olgun nöronlara yeniden programlaşmasını sağlar. Bir vibratom kullanarak elektrofizyoloji için beyin dilimleri hazırlamak için, yüksek hızda striatal seviyeye aşağı en rostral kısmından beyin bölümü.
Daha sonra saniyede 0.1 milimetre hızla 275 mikrometre de striatum koronally bölüm. Her bölümden sonra, enjekte edilmeyen striatal tarafı dikkatlice çıkarın ve enjekte edilen tarafı oda sıcaklığında su banyosunda bir alt ağ ve oksijenli CREB duyu slaytı ile bir şişeye aktarın. Tüm bölümler kesilene kadar şişeyi oda sıcaklığında tutun.
Daha sonra, yavaş yavaş 37 santigrat derece su banyosu sıcaklığını artırmak ve 30 dakika bekletin, sonra ısıtıcı kapatın ve oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Bir doku kesitini elektrofizyoloji için bir kayıt odasına aktardıktan sonra, cam pipeti kayıt elektrotuna monte edin ve çözeltiye indirin. Elektrotun direncini iki kez kontrol edin.
Daha sonra, yavaş yavaş pipet ile yeniden programlanmış hücre yaklaşım, ucu takmaönlemek için elektrot hafif bir pozitif basınç tutarak, ve hücre yama önce GFP pozitif olup olmadığını kontrol edin. Hücre yamalı olduğunda, eksi 60'tan eksi 70 milivolta kadar olan mevcut kıskaçtaki hücreyi koruyun ve eylem potansiyellerini tetiklemek için eksi 20 ila artı 90 pikoamperes enjekte edin. Bu bir nöronal olgunlaşma ve başarılı yeniden programlama göstergesidir.
Daha sonra, voltaj kıskacına geçin ve 10 milivoltun depolarize basamaklarında içe doğru sodyum ve gecikmiş potasyum akımlarının düzeltilmesini ölçün. Burada olgun nöronal morfolojisi ve dendritik dikenler gösterir biocytin dolu yeniden programlanmış nöron kayıtlı bir yazı. Burada, yeniden programlanan nöronların elektrofizyolojik kayıtları spontan aktivite önlemleri ile postsinaptik fonksiyonel bağlantıların varlığını göstermektedir.
İzler pikrotoksin ile bloke inhibitör aktivitesi ni, bir GABAA reseptör antagonisti ve CNQX ile bloke uyarıcı aktivite, bir AMPA reseptör antagonisti. Yamalı nöronlar zaten beş hafta post-enjeksiyon de postsinaptik aktivite göstermek, ve sekiz ve 12 hafta post-enjeksiyon devam. Mevcut indüklenen etki potansiyelleri ile nöronların sayısı da zamanla artar.
Daha ayrıntılı bir analiz, hücrelerin çoğunluğunun parvalbumin internöronlarına benzer hızlı spiking aktivitesi gösterdiği birkaç farklı ateşleme paterni ortaya çıkardı. 12 hafta sonra yapılan immünohistokimyasal analizlerde muhabir GFP ve parvalbumin'in ortak ifadesi ortaya çıktı. Bu prosedürü takiben yama arama tekniği ile gen ekspresyonunu inceleyebilir veya monosinaptik izleme ve iDISCO ile üç boyutlu sinaptik bağlantıyı değerlendirebilirsiniz.
Şimdi internöronlar ifade parvalbumin içine yerleşik glia yeniden programlamak mümkün olduğu için, bu otantik olup olmadığını ve bir tedavi aracı olarak kullanılabilir araştırmaya başladı. Hayvanları kullanırken ve AAV virüsü kullanırken belirlenen protokollere ve yönergelere uymayı unutmayın.
