Bu protokol araştırmacılar meme epitel hücrelerinin farklı alt kümelerinden insan meme kanseri gelişimini özetlemek için fare modeli yeni bir tür oluşturmada yardımcı olacaktır. Bu teknik araştırmacılar bir hücre tipi belirli bir şekilde ve kapsamlı fare ıslahı için bir ihtiyaç olmadan gelişimsel evre doku meme kanseri fare modelleri oluşturmak için izin verir. Bu yordamı başlatmak için metin protokolünde açıklandığı gibi floxed fareleri oluşturun, koruyun ve büyütün.
Fareyi ameliyatın yapılacağı yerden ayrı bir alana getirin. Bir ayak tutam yaparak anestezi doğruladıktan sonra, cerrahi işlem için hazırlamak için kilogram başına beş miligram bir dozda analjezi subkutan olarak Meloxicam enjekte. Epilasyon kremi birkaç damla uygulayarak meme cerrahi site ortaya çıkarmak.
Yumuşak kağıt havlu kullanarak aşırı krem ve gevşek saç çıkarın. Meme uçlarının zarar görmesini önlemek için tıraş önerilir. Cerrahi bölgeyi ilk önce %70 alkol le iyodophors ile dezenfekte edin ve son uygulama scrub iodophors ile sona erer.
Bunu çalışma alanının merkezinden çevreye doğru bir gazlı bez sünger ivedilik veya pamuk uçlu aplikatör kullanarak dairesel bir hareketle yapın. Döngüyü 3-4 kez tekrarlayın. Cerrahi işlem boyunca aseptik teknikler kullanın.
İki dördüncü inguinal meme bezleri arasında yaklaşık bir santimetre uzunluğunda cilt üzerinde bir kesi sitesi olun. Dikkatle meme duktal ağaç görsel olarak parietal periton deri flep ayırın. Dikkatle bir mikrodiskes makas kullanarak yakındaki herhangi bir cilt kesmeden dış meme kaldırmak için saatçilerin forceps ile meme tutun.
25 mikrolitrehamilton şırıngasına yaklaşık 3-5 mikrolitre Cre-adenovirüs enjeksiyon karışımı yükleyin ve 33 gauge metal göbek iğnesi yapıştırın. Karışımda bulunan mavi boyaya göre şırıngadaki enjeksiyon karışımının hacmini tahmin edin. İnce kavisli bir cıvık cıvık ile cilt kapağının kenarını hafifçe tutun ve meme kanalı ağacına mavi boyanın yayılmasını izlerken Cre-adenovirus enjeksiyon karışımını yavaşça meme ucuna enjekte edin.
Duktal lümenin zarar görmesini önlemek için enjeksiyon hızını mümkün olduğunca yavaş koruyun. Başarılı bir intradüktal enjeksiyon stroma bölmesi içine sızmadan tüm duktal ağaç yayılmış enjekte sıvılar tarafından gösterilir. Enjekte edilen sıvının herhangi bir sızıntısını önlemek için iğneyi meme ucundan yavaşça çekin.
Meme bezinin distal tarafını veya enjekte edilen meme ucunun çevresini inceleyin. Burada gösterildiği gibi yakındaki stroma difüzyon Boya başarılı bir intradüktal enjeksiyon yerine bir meme yağ pedi enjeksiyonu gösterir. Derideki cerrahi yaraları yara klipsleri ile kapatın.
Fareyi anesteziden çıkarın ve iyileşmek için temiz bir kafesin içine bir ısıtma yastığına yerleştirin. Metin protokolünde açıklandığı gibi meme tümörü gelişimini izleyin. İntraduktal enjeksiyonun başarıyla yapıldığı en genç dişi fareler yaklaşık üç haftalık farelerdir.
Çoğu meme tümörü indüksiyon deneylerinde genç yetişkin dişi fareler kullanılmaktadır. Enjeksiyon karışımıdaha büyük bir hacim ile intraduktal enjeksiyon alveoler hücreleri hedef erken ve orta gebelik sırasında dişi farelerde yapılabilir. Mammary tümör indüksiyonu için farklı meme epitel hücre alt popülasyonlarını hedeflemek için, enjeksiyon için farklı mammary epitel hücre alt kümesi spesifik organizatörlerin kontrolü altında Cre-adenovirüsler kullanıldı.
Örneğin krem-adenovirüs keratin kontrolü altında 8 organizatörü luminal meme epitel hücrelerini hedeflemek için kullanılmıştır. Keratin kontrolü altında Cre-adenovirus 5 organizatörü sadece bazal meme epitel hücrelerinin genetik işaretleme yol açan bazal soy hedeflenmiştir. Bir ROSA26-YFP muhabiri ile bir kadın P53 floxed homozigot fareler için, keratin intraduktal enjeksiyon 8 Cre-adenovirus enjeksiyondan birkaç ay sonra meme tümörlerinin gelişmesine yol açtı.
Koşullu R26-Y muhabirinin dahil edilmesi nedeniyle tümör epitel hücreleri tipik olarak YFP ile işaretlendi ve akış sitometrisi ile saptandı. Hücreler daha fazla analiz için YFP pozitif hücrelerin akış sıralama ile zenginleştirilmiş olabilir. Bu prosedürü çalışırken hatırlanması gereken en önemli şey küçük bir enjeksiyon hacmi kullanmak, yavaş yavaş enjekte etmek ve aynı zamanda yavaş yavaş iğne çekmek vardır.
Bu prosedürü takiben, hedeflenen YFP pozitif meme epitelyal hücrelerinin, enjekte edilen bezin akış sitometrisi veya ko-immünofülans boyama ile pre-malign ve kanser evrelerine ilerlemesini izleyebilirsiniz. Bu teknik, araştırmacıların meme kanserinin kökeni ne kadar farklı otojenik olaylara nasıl tepki verdiklerini ve kanser hücrelerine nasıl ilerlediklerini incelemelerinin önünü açacaktır. Hem adenovirüs hem de enjeksiyon iğnesi potansiyel olarak tehlikelidir.
Bu nedenle, intradüktal enjeksiyon yaparken her zaman eldiven takmalı ve güvenlik iğneleri ve şırıngalar kullanılmalıdır.
