Этот протокол поможет исследователям создать новый тип мыши модели, чтобы резюмировать развитие рака молочной железы человека из различных подмножества млекопитающих эпителиальных клеток. Этот метод позволяет исследователям генерировать модели мышей рака молочной железы в тканях стадии развития на клеточном типе специфическим образом и без необходимости обширного разведения мышей. Чтобы начать эту процедуру, генерировать, поддерживать и анестезировать floxed мышей, как описано в текстовом протоколе.
Принесите мышь в область отдельно от места, где операция должна быть выполнена. После подтверждения анестезии, выполняя щепотку ноша, ввините мелоксикам в качестве анальгезии подкожно в дозе пять миллиграммов на килограмм, чтобы подготовиться к хирургической процедуре. Разоблачить сосок хирургического сайта, применяя несколько капель крема для удаления волос.
Удалите лишние сливки и свободные волосы с помощью мягких бумажных полотенец. Бритье не рекомендуется, чтобы избежать повреждения сосков. Дезинфекция хирургического участка с помощью иодофоров сначала сопровождается 70% алкоголем и заканчивается окончательным применением скраб-иодофоров.
Делайте это круговыми движениями от центра рабочей области к периферии с помощью марлевой губки или хлопчатобумажного аппликатора. Повторите цикл три-четыре раза. Используйте асептические методы на протяжении всей хирургической процедуры.
Сделайте разрез на коже длиной около одного сантиметра между двумя четвертыми паховой молочной железы. Тщательно отделить лоскут кожи от теменной брюшной поли, с тем чтобы визуальное молочное протоковое дерево. Тщательно держите сосок с watchmakers'forceps, чтобы удалить внешний сосок без резки любой соседней кожи с помощью ножниц микродиссекции.
Загрузите примерно три-пять микролитров смеси инъекций Cre-аденовируса в 25 микролитерный шприц Hamilton с прикрепленной иглой 33-го калибра. Оцените объем инъекционной смеси в шприце на основе синего красителя, включенной в смесь. Аккуратно удерживайте край лоскута кожи с тонкой изогнутой пинцетом и вводите смесь инъекций Cre-аденовируса медленно в сосок, отслеживая распространение синего красителя в молочное протоковое дерево.
Поддерживайте скорость инъекций на медленном, насколько это возможно, чтобы избежать повреждения протокового люмена. Успешная инъекция интрадукторов указывается инъекционными жидкостями, распространяющиеся по всему протоковому дереву, не просачиваясь в стромный отсек. Аккуратно свяжите иглу с соска, чтобы избежать утечки вводимой жидкости.
Изучите дистальную сторону молочной железы или прилегающую территорию вводимого соска. Краситель, рассеянный в близлежащей строме, как показано здесь, указывает на инъекцию молочного жира, а не на успешную интрадуктивную инъекцию. Закройте хирургические раны в коже ранами.
Снимите мышь с анестезии и поместите ее на грелку внутри чистой клетки для восстановления. Мониторинг развития молочной опухоли, как описано в текстовом протоколе. Самые молодые самки мышей, для которых интрадуктивная инъекция может быть успешно выполнена те, примерно в три недели возраста.
Хотя для большинства экспериментов индукции молочной опухоли используются молодые взрослые самки мышей. Интрадуктивная инъекция с большим объемом инъекционной смеси может быть выполнена у самок мышей в начале-середине беременности, чтобы нацелить альвеолярные клетки. Для целевой различных млекопитающих эпителиальных клеток субпопуляции для индукции молочной опухоли, Cre-аденовирусы под контролем различных млекопитающих эпителиальных клеток подмножество конкретных промоутеров были использованы для инъекций.
Например, Cre-аденовирус под контролем кератина 8 промоутер был использован для целевой светящихся млекопитающих эпителиальных клеток. Cre-аденовирус под контролем кератина 5 промоутер целевых базальной линии, что приводит к генетической маркировки только базальных млекопитающих эпителиальных клеток. Для самки P53 floxed гомозиготных мышей с репортером ROSA26-YFP, интрадуктивная инъекция кератина 8 Cre-аденовируса привела к развитию опухолей молочной железы через несколько месяцев после инъекции.
Благодаря включению условного R26-Y репортер, опухолевые эпителиальные клетки, как правило, отмечены YFP и могут быть обнаружены поток цитометрии. Клетки могут быть обогащены сортировкой потока положительных ячеек YFP для дальнейшего анализа. Наиболее важные вещи, чтобы помнить при попытке этой процедуры, чтобы использовать небольшой объем инъекций, вводить медленно, а также снять иглу медленно.
После этой процедуры, можно контролировать прогрессирование целевых YFP положительные эпителиальные клетки молочной железы до предзлостных и раковых стадий потока цитометрии или со-иммунофлуоресценции окрашивания вводили железы. Этот метод проложит путь для исследователей для изучения клеток происхождения рака молочной железы, как они реагируют на различные аутогенные события и как они прогрессируют в раковых клетках. Аденовирус и игла для инъекций потенциально опасны.
Поэтому при выполнении интрадуктивной инъекции следует всегда носить перчатки и использовать защитные иглы и шприцы.
