Este protocolo ayudará a los investigadores a generar un nuevo tipo de modelo de ratón para recapitular el desarrollo del cáncer de mama humano a partir de diferentes subconjuntos de células epiteliales mamarias. Esta técnica permite a los investigadores generar modelos de ratón de cáncer de mama en el tejido del escenario del desarrollo de una manera específica de tipo celular y sin necesidad de una extensa cría de ratón. Para comenzar este procedimiento, genere, mantenga y anesthetice ratones con floxed como se describe en el protocolo de texto.
Lleve el ratón a un área separada de donde se va a realizar la cirugía. Después de confirmar la anestesia mediante la realización de un pellizco de los dedos, inyecte Meloxicam como analgesia por vía subcutánea a una dosis de cinco miligramos por kilogramo para prepararse para el procedimiento quirúrgico. Exponga el sitio quirúrgico del pezón aplicando varias gotas de crema de depilación.
Retire la crema excesiva y el cabello suelto con toallas de papel suaves. No se recomienda afeitarse para evitar daños en los pezones. Desinfectar el sitio quirúrgico con yodoforos primero seguido de 70%alcohol y terminar con una aplicación final de yodoforos de exfoliación.
Haga esto en un movimiento circular desde el centro del área de trabajo hacia la periferia usando una esponja de gasa o un aplicador con punta de algodón. Repita el ciclo de tres a cuatro veces. Utilizar técnicas asépticas durante todo el procedimiento quirúrgico.
Haga una incisión en la piel a una longitud de aproximadamente un centímetro entre las dos cuartas glándulas mamarias inguinales. Separe cuidadosamente el colgajo de la piel del peritoneo parietal para visualizar el árbol ductal mamario. Sostenga cuidadosamente el pezón con los fórceps de los relojeros para quitar el pezón exterior sin cortar ninguna piel cercana con una tijera de microdisección.
Cargue aproximadamente de tres a cinco microlitros de la mezcla de inyección de Cre-adenovirus en una jeringa Hamilton de 25 microlitros con una aguja de cubo de metal de calibre 33 colocada. Estimar el volumen de la mezcla de inyección en la jeringa a partir del tinte azul incluido en la mezcla. Sostenga suavemente el borde de la solapa de la piel con una pinza curva fina e inyecte lentamente la mezcla de inyección de Cre-adenovirus en el pezón mientras monitorea la propagación del tinte azul en el árbol ductal mamario.
Mantenga la velocidad de inyección a la menor velocidad posible para evitar daños en el lumen ductal. Una inyección intraductal exitosa está indicada por fluidos inyectados que se extienden por todo el árbol ductal sin filtrarse en el compartimento del estroma. Retire suavemente la aguja del pezón para evitar cualquier fuga del líquido inyectado.
Examine el lado distal de la glándula mamaria o el área circundante del pezón inyectado. El colorante que se difunde en el estroma cercano como se muestra aquí indica una inyección de almohadilla de grasa mamaria en lugar de una inyección intraductal exitosa. Cierre las heridas quirúrgicas en la piel con clips para la herida.
Retire el ratón de la anestesia y colóquelo en una almohadilla de calentamiento dentro de una jaula limpia para su recuperación. Supervisar el desarrollo del tumor mamario como se describe en el protocolo de texto. Los ratones hembra más jóvenes para los que se puede realizar con éxito la inyección intraductal son aquellos a aproximadamente tres semanas de edad.
Aunque para la mayoría de los experimentos de inducción de tumores mamarios, se utilizan ratones hembra adultos jóvenes. La inyección intraductal con un volumen mayor de la mezcla de inyección se puede realizar en ratones hembra durante la gestación temprana a media para atacar las células alveolares. Para dirigirse a diferentes subpoblaciones de células epiteliales mamarias para la inducción de tumores mamarios, se utilizaron para inyección Cre-adenovirus bajo el control de diferentes promotores específicos de subconjuntos epiteliales mamarios.
Por ejemplo, Cre-adenovirus bajo el control del promotor de la queratina 8 se utilizó para atacar las células epiteliales mamarias luminales. El cre-adenovirus bajo el control del promotor de la queratina 5 se dirigió al linaje basal que conduce al marcado genético de sólo células epiteliales mamarias basales. Para una hembra de ratones homocigotos con floxed P53 con un reportero ROSA26-YFP, la inyección intraductal de queratina 8 Cre-adenovirus condujo al desarrollo de tumores mamarios varios meses después de la inyección.
Debido a la inclusión del reportero condicional R26-Y, las células epiteliales tumorales estaban típicamente marcadas por YFP y podían ser detectadas por citometría de flujo. Las celdas se pueden enriquecer mediante la clasificación de flujo de células positivas YFP para un análisis posterior. Las cosas más importantes a recordar al intentar este procedimiento son utilizar un pequeño volumen de inyección, inyectar lentamente, y también retirar la aguja lentamente.
Después de este procedimiento, se puede monitorear la progresión de las células epiteliales mamarias positivas de YFP objetivo a las etapas pre-malignas y cancerosas por citometría de flujo o tinción de co-inmunofluorescencia de la glándula inyectada. Esta técnica allanará el camino para que los investigadores estudien las células de origen del cáncer de mama, cómo responden a diferentes eventos autogénicos y cómo progresan a las células cancerosas. Tanto el adenovirus como la aguja inyectable son potencialmente peligrosos.
Por lo tanto, siempre se deben usar guantes y utilizar agujas y jeringas de seguridad al realizar la inyección intraductal.
