Mikroakışkan Cihaz Kullanılarak siRNA Yüklü Lipid Nanopartiküllerinin Üretimi

Lipid nanopartikül boyutu biyodistribution, anti-tümör etkisi ve gen susturma performansını etkiler. Bu nedenle, LNP boyut kontrol yöntemi, RNA dağıtım sistemleri de dahil olmak üzere nano ilaçlar üretmek için etkili bir tekniktir. iLiNP cihazı olarak adlandırılan bu orijinal mikroakışkan cihaz, 20 ila 100 nanometre arasında değişen LNP boyutunu 10 nanometre aralıklarla kontrol edebildi.

iLiNP cihazı yalnızca siRNA yüklü LNP'ler değil, aynı zamanda tüm mRNA yüklü LNPS ve ribonucleoprotein yüklü LNP'ler üretebilir. Başlamak için lipid etanol çözeltilerini alın ve DOTAP, DSPC, kolesterol ve DMG-PEG2k çözeltilerini 50 ila 10 ila 38,5 ila 1,5 molar oranında karıştırarak siRNA yüklü LNP'leri üretin. Toplam lipit konsantrasyonu sekiz milimolar olarak ayarlayın.

Daha sonra pH 4'te 154 milimoler salin ve 25 milimolar asetat tamponunun sulu çözeltilerini alın ve 0,2 mikrometre membran filtresi veya şırınga filtresinden filtreleyin. 70 mikrogram siGL4'i 25 milimolar asetat tamponun bir mililitresi içinde eriterek siRNA tampon çözeltisini hazırlayın. Bir mililitre cam şırınnayı sırasıyla lipid ve sulu çözeltilerle doldurun.

Şırınd konektörlerini kullanarak cam şırınnaları tepe kılcal damarlarına bağlayın, ardından lipit ve sulu çözeltilerin akış hızını ayarlayın ve lipid ve sulu çözeltileri şırınna pompaları kullanarak iLiNP cihazına ayrı ayrı sokun. LNP süspansiyonlarını iLiNP cihazının çıkışından bir mikrotüpte toplayın. Dört derecede 12 ila 14 kiloDalton moleküler ağırlık kesmeleri diyaliz zarı kullanarak LNP süspansiyonunu dialyze, sırasıyla POPC LNP'ler ve siRNA yüklü LNP'ler için salin veya DPBS'ye karşı bir gecede santigrattır.

Çaprazlanmış LNP süspansiyonlarını mikrotüplerde toplayın ve ardından LNP süspansiyonunun 20 ila 30 mikrolitresini bir mikro kuvars hücresine borulayın. Son olarak, dinamik ışık saçılım ile LNP boyutunu, LNP boyut dağılımını ve çoklu dağılım dizinini ölçün. Toplam akış hızı ve akış hızı oranları gibi farklı akış koşullarında üretilen POPC LNP boyut dağılımı burada gösterilmiştir.

20 ila 100 nanometre arasında değişen hassas LNP boyutları bu iLiNP cihazı kullanılarak kontrol edilebilir. Küçük boyutlu LNP'ler yüksek toplam akış hızı koşullarında oluşturulur. Ayrıca, FRR 5'te oluşturulan LNP boyutları, toplam akış hızından bağımsız olarak FRR 3'ün boyutlarından daha küçüktür.

SiRNA yüklü LNP'lerin boyut dağılımı burada gösterilmiştir. siRNA'lar, katyonik lipit DOTAP ve negatif yüklü siRNA'lar arasındaki elektrostatik etkileşimle LNP'lere kapsüllenir. iLiNP cihazı, dar bir dağılıma sahip 90 nanometre siRNA yüklü katyonik LNP üretti.

Cationic lipid ile negatif yüklü siRNA'lar arasındaki elektrostatik etkileşim nedeniyle siRNA kapsülleme verimliliği %95 idi. Sitotoksiklik ve 19 nanometre siRNA yüklü LNP'lerin gen susturma aktivitesi değerlendirildi. siRNA yüklü LNP'ler 10 ila 100 nanomoler siRNA dozda sitotoksisite gösterdi.

SiRNA konsantrasyonuna bağlı olarak luciferaz ekspresyon seviyesi azaldı. SiRNA yüklü LNP'ler 100 nanomoler siRNA dozda% 80 luciferaz ekspresyonunu bastırdı. Akış koşullarının optimizasyonları, istenen boyutta LNP'leri elde etmek için protokoldeki en önemli adımlardır.

iLiNP cihazı da dahil olmak üzere mikroakışkan tabanlı LNP üretim yöntemi karmaşık bir prosedür gerektirmez ve standart LNP üretim yöntemi olarak istihdam edilmesi beklenir.