Yamalı kıskaç deneylerinde kullanılmak üzere atriyal miyositlerin izole edilebilip hem hücresel hem de moleküler düzeyde atriyal elektrofizyolojiyi anlama ve bilgi birikimini büyük ölçüde ilerletmiştir. Kullandığımız yaklaşım, çok çeşitli deneysel model ve koşullarda hücresel atriyal elektrofizyoloji ve aritmiogenezi araştırmak için kullanılabilecek çok sayıda izole atriyal atriyal miyosit verir. Atriyal miyositleri izole etmek için gövde sindirim yaklaşımını benimsedik.
Bu yaklaşımın avantajı, araştırmacının araştırmak istedikleri bölgeyi seçmesine olanak sağlamasıdır. Bu yordamı metin protokolünde açıklandığı şekilde ekipman ve çözümlerin hazırlanması ile başlayın. Kesme plakasını, kesme aletlerini, Pasteur pipetini ve ateş cilalı pipetleri yerleştirin.
Bu protokol erkek veya dişi yabani fareler, genetik mutasyonlar taşıyan fareler ve fare hastalık modelleri üzerinde yapılabilir. Metin protokolünde açıklandığı gibi fare ötenazisini takiben, fareyi bir kağıt havlu ya da mantar tahtasıüzerine yerleştirin ve fareyi yerinde tutmak için pençeleri bantlayın. Farenin göğsünü %70 etanol ile ısla.
Kavisli makas kullanarak göğsü kaplayan kürk ve deriyi çıkarın. Sonraki sternum kaldırmak ve daha sonra kaburga kenarı boyunca diyafram kesmek için sıçan diş forseps kullanın. Kalbi ortaya çıkarmak için kavisli makas kullanarak tüm göğüs kafesini çıkarın.
Atriyal uzantAyı kaldırmak için, ince kesme forsepsi kullanarak uzantayı hafifçe kaldırın ve yaymakla kesin. Atriyal uzantıyı hemen 20 mililitre ısıtılmış modifiye Tyrode'un pH 7.4 çözeltisi içeren silikon kaplı bir kesme kabına aktarın. Atriyal uzantının açılışının altına bir kesme pimi ve bir iğne yerleştirin.
Pasteur pipeti kullanarak, kan kaldırmak için ısıtılmış modifiye Tyrode's pH 7.4 çözeltisi ile atria floş. Atriyal uzantAyı üst ve alt kenarı boyunca keserek açın. Daha sonra, düz bir dikdörtgen doku parçası oluşturmak için atriyal uzantının köşelerini aşağı sabitle.
Atriyal uzantAyı yay makası ve ince çifenekler kullanarak yaklaşık 8 ila 10 eşit büyüklükte şeritler halinde kesin. Şeritlerin ana doku parçasından serbest kesildikten sonra daraldığını unutmayın. Küçük delik yangın cilalı pipet kullanarak, ısıtılmış modifiye Tyrode pH 6.9 çözeltisi içeren ilk tüp içine doku şeritler imal aktarın.
Beş dakika bekleyin. Şimdi, modifiye Tyrode pH 6.9 çözeltisi içeren ikinci yuvarlak dipli tüp doku şeritleri aktarmak için orta delik yangın cilalı pipet kullanın. Doku şeritleri yıkamak için, beş mililitre yuvarlak dipli tüp kap ve yavaşça tüp üç kez ters.
Doku şeritleri orta delik yangın cilalı pipet kullanarak üçüncü tüp doku şeritleri transfer etmeden önce tüpün altına yerleşmek sağlar. Şeritleri ters çevrilerek tekrar yıkayın. Daha sonra, 30 dakika boyunca orta delikli ateş cilalı pipet ve kuluçka kullanarak enzim çözeltisi içine doku şeritleri aktarın.
Doku şeritlerinin birbirine yapışmasını önlemek için tüpü her üç ila beş dakikada bir döndürün. Enzimatik sindirim başında, doku şeritleri hızla girdap aşağıdaki yerleşmek. Yaklaşık 20 dakikalık sindirimde doku şeritleri dönen sonrasında enzimatik çözeltide yüzmeye başlar.
Bu süre zarfında, atriyal doku şeritleri de sindirilir gibi beyaz soluk pembe görünüm değişir. Enzimatik sindirimden sonra, hazırlanan beş mililitrelik yuvarlak dipli tüplerde 2,5 mililitre KB çözeltisi kullanarak üç yıkama yapın. Her yıkama için, hafifçe orta delik yangın cilalı pipet kullanarak bir sonraki tüp için doku taşımadan önce tüp üç kez ters.
Son yıkamadan sonra şeritleri 2,5 mililitre KB çözeltisi içeren 14 mililitrelik yuvarlak dipli tüpe aktarın. Beş dakika bekleyin. Yavaşça geniş delik yangın cilalı pipet kullanarak 7,5 dakika boyunca doku triturate.
Bu mekanik doku şeritleri ayrıştırmak ve bireysel atriyal miyositler ile dolu bulutlu bir çözüm verim olacaktır. Triturasyonun ilki, hücrelere zarar vermeden çok sayıda hücre yiyecek şekilde uyarlanmalıdır. Farelerin yaşı ve hastalık durumu gibi faktörleri göz önünde bulundurun.
Trigunasyon kuvvetini, doku şeritlerini geniş delikli ateş cilasından çıkarmanın hem sıklığını hem de hızını değiştirerek bireysel izolasyona göre uyar. Hafif triturasyon düşük hücre verimi ile sonuçlanırken, sert triturasyon birçok ölü hücre verir. Triturated doku şeritleri içeren 14 mililitrelik yuvarlak dipli tüpü, deneysel kullanım için istenen hücre yoğunluğuna bağlı olarak 7 ila 10 mililitrelik son bir hacimle KB çözeltisi ile doldurun.
Bu tüpü oda sıcaklığında bir saat yerleştirin. Bu kuluçka dönemini takiben, hücreler yedi saate kadar çeşitli deneyler için kullanılabilir. Burada normal farelerden izole atriyal miyosit örnekleri gösterilmiştir.
İzole atriyal miyositler genellikle 100 mikron uzunluğunda ve 10 mikron genişliğinde açık striations ile sırayla vardır. İzole atriyal miyositlerin kapasitansı tipik olarak 40-70 pikofaraddır. Geçerli kelepçe modunda delikli yama-kelepçe tekniği kullanılarak kaydedilen atriyal miyosit eylem potansiyeline bir örnek gösterilmiştir.
Yama-kelepçe tekniğinin tüm hücre konfigürasyonunda temsili bir sodyum akım ailesi kaydedildi. Bu akımlar negatif 120 milivolt luk bir tutma potansiyelinden negatif 100 ile pozitif 10 milivolt arasında 50 milisaniyelik gerilim kıskacı adımları kullanılarak kaydedildi. Burada sodyum akım gerilimilişkisinin özeti sunulmuştur.
Temsili bir kalsiyum akım ailesi, negatif 70 milivoltluk bir tutma potansiyelinden negatif 60 ve pozitif 80 milivolt arasında 250 milisaniyelik voltaj kıskacı adımları kullanılarak kaydedildi. Burada bir özet kalsiyum akım gerilimi ilişkisi görüntülenir. Potasyum akımları temsili bir aile negatif 120 milivolt ve pozitif 80 milivolt arasında 500 milisaniyelik voltaj kıskaç adımları kullanarak negatif 80 milivolt tutma potansiyelinden kaydedildi.
Burada toplam potasyum akımı için özet akım gerilimilişkisi gösterilmiştir. Başarılı bir atriyal miyosit izolasyonunun hem uygun enzimatik sindirime hem de triturasyon sırasında hücrelerin mekanik ayrıştırılmasına bağlı olduğunu unutmamak önemlidir. İzole edildikten sonra, atriyal miyositler etki potansiyeli morfolojisi ve sodyum akımları, kalsiyum akımları ve potasyum akımları gibi iyonik akımların ölçümleri için yama-kıskaç deneylerinde kullanılabilir.
Atriyal miyosit elektrofizyolojisindeki değişikliklerin araştırılması, atriyal aritmileri tehdit eden yaşamın hücresel ve moleküler temelinin belirlenmesi ve atriyal aritmiler için anti-aritmik bileşiklerin geliştirilmesi ve test edilmesi için gereklidir.
