Protokolümüz, büyük bir sorun olabilecek bakteri kontaminasyonunu önlemeye odaklanarak primer fibroblast izolasyonu için kolay ve hızlı bir yaklaşım sağlar. Özellikle de yeni başlayanlar için. Tekniğimizin en büyük avantajı sadeliğidir.
Geniş manuel beceri veya deneyim gerektirmez ve kısa bir eğitim süresi içinde herkes tarafından kolayca öğrenilebilir. Tekniği sunan Manja Newe, laboratuvar dışından bir teknisyen olacak. Diseksiyonun başlamasına başlamadan önce, biri üst üste olmak üzere iki çift tek kullanımlık eldiven giyin.
Ve fareyi polistiren pede sabitle. Kürkü %70 etanol ile dezenfekte ederek hayvanın Sırılsıklam olduğundan emin olun. Ve etanol sterilize cerrahi forceps ve atravmatik makas sağ ürogenital sistem üzerinde cilt fincan kullanın.
İlk kesiden boynuna kadar orta hat boyunca 3-4 santimetre kesin ve uzuvlarda kabartma kesikler eklenin. Ve karın boşluğu kapsayan kas en iyi erişim elde etmek için ped için deri pin. Sonra, taze% 70 etanol ile karın kas iki kez dezenfekte.
Etanol kuruduğunda, ilk eldiven çiftini çıkarın. Ve karın boşluğu ve toraks açmak için kas tabakası incise için forceps ve makas yeni bir steril set kullanın. İlgi organları kaldırmak için, yavaşça doku piercing olmadan cerrahi forceps ile her organ kavramak.
Ve makas dikkatle organın giriş noktası yakınında temin kan damarları kesmek için kullanın. Steril, soğuk PBS bir tüp içine her organ yerleştirin ve sıkıca tüp kapatın. Organlar toplanır gibi ıslak buz üzerinde her tüp yerleştirerek.
Tüm organlar hasat edildiğinde, steril bir hücre kültürü başlık yerleştirmeden önce% 70 etanol ile tüpler sprey. Yeni bir çift eldiven giyerek, her organı steril altı santimetrelik Petri kabının yarısına aktarmak için steril çöfler kullanın. Ve kısaca fazla kan kaldırmak için taze PBS ile organları yıkayın.
Durulan organları her Petri kabının ikinci yarısına aktarın ve fazla PBS'yi çıkarın. İki steril neşter kullanarak, organları bir ila iki milimetrelik parçalarhalinde doğrama. Ve doku parçalarını yeni, bireysel, steril, 15 mililitrelik tüplere aktarmak için steril bir spatula kullanın.
Her tüpe %0,25 Tripsin çözeltisi iki mililitre ekleyin. Ve tüpleri 5 dakika lığına 37 derecede bir hücre kültürü kuvöze yerleştirin. Kuluçka sonunda, on saniye boyunca dakikada yaklaşık 1400 dönüşler tüpler girdap.
Ve tüp başına fetal buzağı serumu ile takviye uygun bir kültür ortamı dört mililitre ile Tripsin reaksiyonu tutuklamak. Sonra, her tüp için kollajenaz karışım çözeltisi uygun hacmi ekleyin. Ve tüpleri 37 derece ultrasonik su banyosuna 10 dakika yerleştirin.
Sonication sonunda, yavaşça 10 saniye boyunca tüpler girdap. 10 dakika daha ultrasonik su banyosu içine tüpler geri yerleştirmeden önce. İkinci sonication sonunda, 10 saniye daha tüpler girdap.
Ve tüpleri %70 etanolle dezenfekte edin. Hücre kültürü başlığında, hücre süspansiyonlarını tek tek 40 mikrometresüzden yeni, steril, 15 mililitrelik bir tüpe süzün. Ve santrifüj ile hücreleri toplamak.
Tüp başına bir mililitre taze ortamda peletleri yeniden askıya alın. Ve uygun kaplama yoğunluklarında uygun hücre kültürü damarlarında hücreleri görmek. Sonra, hücre kültürü kuluçka gece hücreleri yerleştirin.
Ertesi sabah, taze ortam eklemeden ve hücreleri kuvöze geri vermeden önce her kültürü PBS ile üç kez yıkayın. Bu protokol kullanılarak, sonraki deneylerde kullanılmak üzere uygulanabilir fibroblastlar elde edilebilir. Amino floresan boyama veya proliferasyon deneyleri gibi.
Erişkin fibroblastlar genellikle monolayers büyümek birden fazla hücresel süreçleri ile düz, iğ şeklinde hücrelerdir. Ancak farklı organlardan fibroblast popülasyonlarında belirgin morfolojik farklılıklar görülebilir. Örneğin, renal fibroblastlar daha küçüktür ve kardiyak, pulmoner veya hepatik fibroblastlara göre daha yüksek yoğunlukta büyürler.
İzole fibroblastlar yüksek çoğalma oranları sergilerler ve yaklaşık altı gün sonra %90'dan fazla optik bir kesişme meydana ulaşırlar. Burada, ayırt edici alfa düz kas aktin mikrofilamentleri ile farklılaşmış bir miyofibroblast görülebilir. Bu hücreler kalp, böbrek, karaciğer ve akciğer hücre kültürlerinde bolmiktarda bulunur.
İzole ve kültürlü hücrelerin sadece yaklaşık yüzde 20-30 düzenli ifade ederken, düzenlenmiş, alfa düz kas aktin mikrofilamentler, hemen hemen tüm hücrelerin Vimentin ve Diskoidin Etki Reseptörü için pozitif 2 kültür yedi gün sonra. Unutulmaması gereken en önemli şey, bakteri kontaminasyonundan kaçınılması gerektiği için prosedür boyunca doğru tekniği kullanmaktır. Primer fibroblast izolasyonundan sonra hücreler her türlü psikiyatri deneyi ve karakterizasyonu için kullanılabilir.
İmmünsitik kimyanın çoğalması veya yara iyileşmesi denemeleri veya moleküler biyolojik değerlendirmeler gibi.
