Yazarlar Nadine Woitasky ve Peter Volk teknik yardım için teşekkür ederiz. Buna ek olarak, yazarlar Bayan Claudia Lorenz (tıbbi yazar, ACCEDIS) yazının hazırlanmasında yardım için teşekkür ederiz. Bu el yazması mali DFG (Schlu 324/7-1) tarafından desteklenmiştir.

soruşturma bakım ve kullanım laboratuvar bize Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından (NIH yayın No 85-23, 1996 revize) Yayınlanan Hayvanlar için kılavuzuna göre yapılır. Genel olarak, erkek wistar fareler 3-4 ay yaşlı ve 250-350 g bir ortalama ağırlığı ile bu iletişim kuralı için kullanılır. Bir sıçan kalp 20 kültür yemekleri için yeterli (çanak başına 1 mL; iç çap: 35 mm) 1.5 x 10 4 hücreleri/1000 mm 2 yaklaşık hücre yoğunluğu ile.
 1. medya hazırlık ve Kimyasalları <ol><li>kreatin-karnitin-taurin orta (CCT orta) Not: SKK orta orta 199 kreatin, karnitin ve taurin ilavesi ile dayalı karmaşık bir orta olduğunu.
	<ol><li>Hazırlamak 1 L orta 199: 3,6 g Hepes ekleyip karıştırın 1 h için. O zaman 655.5 mg kreatin (5 mM), 395.4 mg karnitin (2 mM) ve 625.5 mg taurin (5 mM) ekleyin. Karnitin ve taurin değiştirmek için pH &#60; 7. Herhangi bir bulaşıcı hücreleri, örneğin endotel hücreleri veya fibroblastlar büyümesini inhibe için 10 µM sitozin β-D-arabinofuranoside Orta olarak ekleyin. NaOH (2 mM) ile pH 7.4 ve steril filtre orta ayarlayın. Saat 4'te SKK orta saklamak ° C.</li>
	</ol></li> <li>Powell orta <ol><li>1 L Powell orta için 6,43 g NaCl (110 mM) 0,19 g KCl (2.5 mM), 0,16 g KH 2 PO 4 (1,2 mM), 0.3 g MgSO 4 7 H 2 O (1,2 mM), ile 5.96 g Hepes (25 mM), dağıtılması ve 1.98 g D (+ )-Aqua steril glukoz monohidrat (10 mM). NaOH (2 M) ile pH 7.4 ve steril filtre orta ayarlayın. Mağaza Powell orta 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Kalsiyum klorür (CaCl 2) <ol><li>100 mM CaCl 2 çözüm (50 mL) ve aliquots içeren 500 µL CaCl 2 hazırlayın. Aliquots -20, dondurma ° C.</li>
	</ol></li> <li>Hazırlanması kültür orta <ol><li>hazırla üç hücre kültür ortamları: Orta, kaplama orta ve çamaşır orta Pre-Kaplama. SKK orta için tüm üç ortamlarda (Tablo 1) temel. SKK orta kültür çanak başına 1 mL ile hesaplayın. Bu nedenle, 20 mL SKK orta 20 kültür yemekleri için hazırlamak (İç Çap: 35 mm).</li>
		<li>Hücre kültür plakaları: her hücre kültür plaka kat (İç Çap: 35 mm) 1 mL orta Pre-Kaplama ile. Kaplamalı plakalar gecede 37 ° C'de veya en az 2 h için kullanmadan önce mağaza.</li>
	</ol></li></ol> 2. İzolasyon-in yetişkin Cardiomyocytes <ol><li>Langendorff hazırlık perfüzyon sistemi <ol><li>ısı kaplama orta ve çamaşır orta 37 ° C. 500 µL CaCl 2 tüp Defreeze ve collagenase içinde 25 mg tartmak.</li>
		<li>Floş Langendorff perfüzyon sistemi ile aqua steril, daha sonra Powell orta sistem 5 dakika süreyle dolaşımda izin</li>
		<li>Olmadan herhangi hava kabarcıkları ve gaz %95 oksijen ile orta Langendorff perfüzyon sistemi 80 mL Powell orta ile doldurulması.</li>
		<li>Bir tüp (50 mL) 40 mL Powell orta ile hazırlamak, 37 ° C ısı ve % 95 oksijen ile gaz.</li>
		<li>Kanül için kaldırılan kalp eklemek için bir iş parçacığı yaklaşık 25 cm uzunluğunda hazırlayın.</li>
		<li>Jilet alkol (Hacmen % 70) ile Isıtınız ve helikoptere tutturmak. Plastik bir disk helikopter kelepçe.</li>
	</ol></li> <li>Kalp çıkarımı <ol><li>% 4-5 isoflurane bir erkek wistar fareyle anestezi ve servikal çıkığı ile kurban. Karın kostal kemerin arkasında bir karın kesme ile açın ve makas aynı çifti ile göğüs boşluğuna açmak için diyafram kesti.</li>
		<li>Kalp, akciğer ve timus, ile birlikte göğüs boşluğunda timus son derece beyin yukarıda keserek çıkarın. Malzeme buz gibi tuzlu eriyik-e doğru hemen transfer.</li>
		<li>Kessin makas (büyük) ile kalp akciğer ve timus kaldırmak ve malzeme ile kapsül forseps sabitliyor tarafından ikinci yeni bir serum fizyolojik çözüm transfer.</li>
	</ol></li> <li>Yalıtım <ol><li>kapsül forseps ve parçalanmış makas (büyük ya da küçük) kullanarak kalp artıkları timus, Trakea, yağ ve bağ dokusu gibi aşırı doku kaldırmak. Aort damarı ortaya çıkarmak ve birinci ve ikinci bransiyal arch. arasında parçalanmış bir makas (büyük ya da küçük) ile sever</li>
		<li>Langendorff perfüzyon sistemi damlama başlatın. Kalp Langendorff perfüzyon sistemi kanül yerleştirin ve ilk bir timsah kelepçe ile ve daha sonra hazırlanan iplik ile bağlamak. Kalp kan boşalana kadar yıkayın.</li>
		<li>25 mg Collagenase 5-6 mL sıcak Powell ortamda dağıtılması ve 12.5 µL CaCl 2 (30 µM) ekleyin.</li>
		<li>Kan dolaşımı Langendorff perfüzyon sistemi ile damlama kalp üzerinde bağlı bir cam huni hareket ettirerek kapatın ve perfüzyon sistemi çözüldü collagenase ekleyin. Perfüzyon 25 min için saniyede 1 damla damla hızının başlayın. 
		Not: perfüzyon sırasında kalp şişmeye ve balmumu bir görünüm olsun.</li>
		<li>25 min sonra perfüzyon durdurmak ve kalp Langendorff perfüzyon sistemden kaldırmak. Kalpten aort, Kulakçık ve bağ dokusu kaldırın ve sağ ve sol ventriküllerin açın.</li>
		<li>Chop 90 ° açılı iki kez kalp (kesme genişliği: 0.7 mm; hız: 0.15 cm/s). 10 için el ile iki neşter ile bu işlemi tekrarlayın s her iki tarafı.</li>
		<li>Perfüzyon Orta 12 mL (50 mL) yeni bir tüp içine aktarın. 37 başka bir beş dakikalığına bu orta ve Özet hücrelere hücre Bulamaç dökün ° C. Mix her dakika çözüm.</li>
		<li>Naylon mesh (200 µm) yeni tüp (50 mL) içine sindirilmiş kalbine Çözümle filtre.</li>
		<li>, 29 x g 3 dk. atma filtre uygulanmış çözüm süpernatant santrifüj kapasitesi ve 12.5 µL CaCl 2 (250 µM) hücre Pelet için de dahil olmak üzere 6 mL sıcak Powell orta ekleyin. Pelet pürüzsüz sallayarak hareketleri ile resuspend. 29 x g 2 dk. atma süpernatant için de yine santrifüj kapasitesi ve 6 mL sıcak 25 µL CaCl 2 ile (500 µM) Powell orta yerine ekleyin. Hücre Pelet nazik sallayarak hareketleri aracılığıyla dağıtılması ve 12 mL sıcak Powell orta dahil 120 µL CaCl 2 (1 mM) ekleyin. Santrifüj 16 x g bir üçüncü kez 1 dk için. Yine, süpernatant kaldırmak.</li>
		<li>Hücre Pelet ile Önceden ısıtılmış kaplama orta mix.</li>
		<li>Öncesi kaplama orta kültür plakalar kaldırın. 1 mL her kültür plaka için izole cardiomyocytes de dahil olmak üzere Orta, kaplama aktarın. Taze izole cardiomyocytes için 1 h. 37 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>Kaplama orta kültür plakalar kaldırın. 1 mL orta ve her kültür plaka yıkama ekleyin ve 37 ° C'de plakaları için altı gün orta değiştirmeden stok ilâ.</li>
		<li>Farklı kimyasallar ve R.V.C tedavisi etkisini araştıran için önce yenilemeniz kaplama orta orta yıkama ve bundan sonra farklı kimyasallar ekleyerek. 
		Not: Değerlendirme ışık mikroskobu ile: her hücre hazırlık ile 150-300 cardiomyocytes günlük ışık mikroskobu tarafından takip edilmelidir. Tüm sayılan cardiomyocytes görünüşlerine göre gruplar halinde alt bölümlere (Örneğin, &#34; çubuk şeklinde &#34;, &#34; yuvarlak aşağı &#34;, &#34; yayılan &#34;, ve &#34; sıradışı görünümü &#34;). Kategori &#34; yayılan &#34; pseudopodia benzeri yapıları ile tüm cardiomyocytes içerir. &#34; Sıradışı görünümü &#34; tüm R.V.C bir düzensiz yüzeyli ve tespit yok sağlam hücre zarı içerir.</li>
	</ol></li></ol> 3. Örnek Deneyler <ol><li><ol><li>analiz morfolojik ve yapısal dönüşüm R.V.C ekimi confocal lazer mikroskobu tarafından sırasında Yetişkin cardiomyocytes Floresans/ayirt boyama. F-aktin yapılarını araştırmak için Phalloidin-TRITC kullanın &#34; çubuk şeklinde &#34;, &#34; yuvarlak aşağı &#34;, ve &#34; yayılan &#34; R.V.C. Üreticiye göre boyama gerçekleştirmek &#39; s protokolü. Phalloidin-TRITC boyama için bir örnek başvuru Nippert ve ark. verilir 11. Floresans/ayirt boyama ile içinde de - ve yeniden - differentiation deneysel tedaviler (Örneğin, ile arasında ekili yetişkin cardiomyocytes contractile cihazları farklılıkları Swiprosin-1, ionomycin) soruşturma olmaktır.</li>
	</ol></li> <li>Gerçek zamanlı kantitatif RT-PCR (qRT-PCR) <ol><li>farklı genler mRNA ifadesi değişiklikleri öğrenmek için qRT-PCR gerçekleştirmek (Örneğin, OSM, Swiprosin-1, β-MHC) R.V.C ekimi sırasında. İçin yeterli örnek boyutu, daha büyük kültür yemekleri kullanın (iç çapı: 60 mm) 2 mL cilt ile. R.V.C beş kültür yemekleri bir örnek verir. MRNA izolasyonu ve cDNA üreticiye göre dönüşümü gerçekleştirmek &#39; s protokolü.</li>
	</ol></li> <li>Immunoblot teknikleri <ol><li>gerçekleştirmek Western protein ifade (Örneğin, Swiprosin-1) R.V.C ekimi sırasında değişiklikleri öğrenmek için engelliyor. Örnek başına bir kültür çanak (1 mL) kullanın.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Schl&#252;ter, K. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cardiomyocytes - Active Players in Cardiac Disease. , (2016).</li><li>Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+calcium+stable+adult+cardiac+myocytes.">Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).</li><li>Schl&#252;ter, K. -. D., Schreiber, D., Fabbro, D., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+ventricular+cardiomyocytes:+isolation+and+culture.">Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture.</a> Protein Tyrosine Kinases: From Inhibitors to Useful Drugs. 290, 305-314 (2005).</li><li>Eppenberger, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+analysis+of+the+regeneration+of+myofibrils+in+long-term+cultures+of+adult+cardiomyocytes+of+the+rat.">Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat.</a> Dev. Biol. 130 (1), 1-15 (1988).</li><li>Burrows, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cultivation+of+tissues+of+the+chick-embryo+outside+the+body.">The cultivation of tissues of the chick-embryo outside the body.</a> JAMA. 55 (24), 2057-2058 (1910).</li><li>Cavanaugh, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsation,+migration+and+division+in+dissociated+chick+embryo+heart+cells+in+vitro.">Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro.</a> J Exp Zool A Eco Genet Physiol. 128 (3), 573-589 (1955).</li><li>Muir, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+observation+on+the+cellular+structure+of+cardiac+muscle.">Further observation on the cellular structure of cardiac muscle.</a> J. Anat. 99, 27-46 (1965).</li><li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium.">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochem. Biophys. Res. Com. 72 (1), 327-333 (1976).</li><li>Schwarzfeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+development+in+cell+culture+of+myocardial+cells+of+the+adult+rat.">Isolation and development in cell culture of myocardial cells of the adult rat.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 13 (6), 563-575 (1981).</li><li>Kubin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncostatin+M+is+a+major+mediator+of+cardiomyocyte+dedifferentiation+and+remodeling.">Oncostatin M is a major mediator of cardiomyocyte dedifferentiation and remodeling.</a> Cell Stem Cell. 9 (5), 420-432 (2011).</li><li>Nippert, F., Schreckenberg, R., Hess, A., Weber, M., Schl&#252;ter, K. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+Swiprosin-1+on+the+formation+of+pseudopodia-like+structures+and+&#946;-adrenoceptor+coupling+in+cultured+adult+rat+ventricular+cardiomyocytes.">The effects of Swiprosin-1 on the formation of pseudopodia-like structures and &#946;-adrenoceptor coupling in cultured adult rat ventricular cardiomyocytes.</a> PLoS ONE. 11 (12), e0167655 (2016).</li><li>Moses, R. L., Claycomb, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorganization+and+reestablishment+of+cardiac+muscle+cell+ultrastructure+in+cultured+adult+rat+ventricular+muscle+cells.">Disorganization and reestablishment of cardiac muscle cell ultrastructure in cultured adult rat ventricular muscle cells.</a> J. Ultrastruct. Res. 81 (3), 358-374 (1982).</li><li>Eppenberger-Eberhardt, M., Flamme, I., Kurer, V., Eppenberger, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reexpression+of+&#945;-smooth+muscle+actin+isoform+in+cultured+adult+rat+cardiomyocytes.">Reexpression of &#945;-smooth muscle actin isoform in cultured adult rat cardiomyocytes.</a> Dev. Biol. 139 (2), 269-278 (1990).</li><li>Fedak, P. W., Verma, S., Weisel, R. D., Skrtic, M., Li, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling+and+failure:+from+molecules+to+man+(Part+III).">Cardiac remodeling and failure: from molecules to man (Part III).</a> Cardiovasc. Pathol. 14 (3), 109-119 (2005).</li><li>Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+myocardial+regeneration.">Mechanisms of myocardial regeneration.</a> Trends Cardiovasc. Med. 21 (2), 52-58 (2011).</li><li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications:+A+consensus+paper+from+an+international+forum+on+cardiac+remodeling.">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an international forum on cardiac remodeling.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 35 (3), 569-582 (2000).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular biology of the cell. , (2015).</li><li>P&#246;ling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Janus+face+of+OSM-mediated+cardiomyocyte+dedifferentiation+during+cardiac+repair+and+disease.">The Janus face of OSM-mediated cardiomyocyte dedifferentiation during cardiac repair and disease.</a> Cell Cycle. 11 (3), 439-445 (2014).</li><li>Decker, M. L., Behnke-Barclay, M., Cook, M. G., Lesch, M., Decker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+evaluation+of+the+contractile+apparatus+in+primary+cultures+of+rabbit+cardiac+myocytes.">Morphometric evaluation of the contractile apparatus in primary cultures of rabbit cardiac myocytes.</a> Circ. Res. 69 (1), 86-94 (1991).</li></ol>

Gösterilen sonuçlar Franziska Nippert doktora tezi bir parçasıdır.

Yetişkin cardiomyocytes in vivo davranışını diğer hücreleri (örneğin, nöronlar, endotel hücreleri, fibroblastlar, inflamatuar hücreler) ve onlar oluşturan elektrik syncytium ile pek çok etkileşimler tarafından etkilenir1. Bu nedenle, Yetişkin cardiomyocytes uyarlaması stres sadece eğitim yalıtım ve R.V.C ekimi gerektirir. İzole ve R.V.C yetiştirilmesi ana etkileri: 1) kesmeden hücre dışı matriks ve hücre-hücre kişiler; 2) contractile uyaranlara kesme...

Yetişkin cardiomyocytes in vivo hücre-hücre kişiler arasında miyositler dayalı bir elektrik syncytium olarak çalışıyorum. Buna ek olarak, kardiyak fibroblastlar, endotel hücreleri, sinir hücreleri ve inflamatuar hücre1gibi bitişik hücreleri tarafından etkilenmektedir. Cardiomyocytes onların hücre içi kuruluşa uyum yeteneği çalışma için iş yükü koşullarının, hangi bir ilk adım kalp yetmezliği, yalıtım ve yetişkin ventrikül sıçan tarımı için lider kalp hipertrofisi sırasında görüldüğü gibi değişmiş cardiomyocytes (R.V.C) gerekli2,3,4' tür. Tarihsel olarak, cardiomyocytes ilk embriyonik piliç kalpler5,6ile izole edildi. Birkaç yıl sonra ölümcül farklılaşmış cardiomyocytes ilk yalıtım kalsiyum azalması7kullanarak tanımlanmıştır. Ancak, bu yetişkin cardiomyocytes kalsiyum dayanıklı değildi ve bu nedenle işlev deneyleri için kullanılamadı. Son olarak, 1976 yılında Powell ve Twist yetişkin Ventriküler cardiomyocytes fizyolojik şartlarda8altında incelemek için yeni bir iletişim kuralı etkinleştirilmiş. İlk adım olarak, onlar yetişkin cardiomyocytes düşük kalsiyum konsantrasyonu ve kademeli bir yordam fizyolojik konsantrasyonları bundan sonra artan kalsiyum altında izole. Bugün, yalıtım ve yetişkin cardiomyocytes ekimi için çoğu protokoller bu kalsiyum protokolü ile iş ve yoğun hücre-hücre kişiler1Enzimatik sindirim için collagenase kullanın.
Başarılı bir tarım için fetal buzağı serum (FCS) veya oncostatin M (OSM) gereklidir. R.V.C gerçekleştirmek bir de - ve yeniden - differentiation sarcomere demontaj ve reformasyon9,10,11,12de dahil olmak üzere kapsamlı yapısal değişiklikler ile. Bu işlem türü fetal genlerin, β-myosin ağır zincir (β-MHC) gibi yeniden ifadeye göre hipertrofisi ve yayılan4,11, olarak da bilinir, pseudopodia benzeri yapıların oluşumu Bilindiği gibi eşlik ediyor 13. swiprosin-1 (EFHD2), yeni saptanan protein, Ayrıca, ekili R.V.C11yeniden farklılaşma sürecinde önemli bir rol oynar. Sonuç olarak, R.V.C kültür kendiliğinden kültür2,4,142-3 hafta sonra kasılmalar göstermek yaygın, polimorfik hücrelere dönüşümü.
Son keşifler taklit eder kültür koşullar altında gerçekleştiği sırada kalp re ve de differentiation görülen vivo içinde kalp remodeling10sırasında,15bulunduğunu ortaya çıkardı. Kardiyak remodeling anahtar işlemi sırasında kalp hastalıkları16' dır. Olarak kalp hastalıkları hala ölüm sanayileşmiş toplumlarda ana nedeni, Yetişkin cardiomyocytes Biyoloji daha iyi anlamak önemlidir (kim; 2015). Yalıtım ve R.V.C ekimi yeni stratejiler ve kalp hastalıklarının tedavisi için ilaç geliştirmek için yardımcı olabilir. Bu makale ile yalıtım ve R.V.C ekimi için bir protokol sağlanır. Ayrıca, bu yöntemin bazı kritik bölümleri tartışma bölümünde vurgulanır.

<table><tbody><tr><td>Langendorff perfusion system</td><td>inhouse construction</td><td></td><td>double-walled with a water&lt;br/&gt; based heating system</td></tr><tr><td>Tissue chopper Mc Ilwain</td><td>Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aortic Cannula, OD 1,8 mm</td><td>inhouse construction</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Abdominal shears</td><td>Aeskulap</td><td>BC772R</td><td></td></tr><tr><td>Capsule forceps</td><td>Eickemeyer</td><td>171307</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissor large</td><td>Aeskulap</td><td>BC562R</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissor small</td><td>Aeskulap</td><td>BC163R</td><td></td></tr><tr><td>Mash with Polyamid</td><td>Neolab</td><td>4-1413</td><td>mash size 200 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>plastic disc</td><td>Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Typ II</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and cultivation of adult rat cardiomyocytes

Sağlam bir kalp içinde yetişkin cardiomyocytes bitişik hücreleri etkiler. Bu hücre spesifik tedaviler ve ortamları altında davranışının kesin bir soruşturma yalıtım yöntemi ve yetişkin cardiomyocytes ekimi ile mümkündür. Bu el yazması için bir protokolü başarılı yalıtım ve yetişkin fare Ventriküler cardiomyocytes (R.V.C) tarımı sunar.
Sıçan tarafından derin anestezi altında servikal çıkığı feda etti. O zaman, kalp çıkarılan ve aort damarı ortaya olduğunu. Daha sonra perfüzyon Langendorff perfüzyon sistemi kalsiyum azalması ve collagenase tedavi ile gerçekleştirilir. Daha sonra ventrikül doku kıyılmış, yeniden sirküle ve filtre, üç Santrifüjü adım CaCl2 kademeli eklenmesi ile fizyolojik kalsiyum konsantrasyonu ulaşılana kadar izledi. R.V.C hücre kültür yemekleri üzerinde kaplama. Hücre kültür orta yenilemeden sonra R.V.C altı güne kadar serum içeren kültür orta değiştirmeden ekili olabilir. R.V.C yalıtım kalsiyum hassas bir işlemdir. Hücre içi kalsiyum konsantrasyonu küçük değişiklikler kalite ve canlılığı izole hücrelerinin azalmasına neden.
Taze izole R.V.C çubuk şeklinde uygulanır. Ekimi ilk gün içinde (yayılan) çubuk şeklinde morfoloji ve form pseudopodia benzeri yapıları kaybediyorlar. Bu morfolojik oluşumu sırasında R.V.C başlangıçta bir reformasyon aktin stres lifleri ve de novo sarcomerogenesis ardından contractile öğelerini bozulmasına yol açar. Ekimi bir hafta sonra en R.V.C yaygın bir görünümü ile açıkça tespit çapraz striation göster. İonomycin ile tedavi yaymak zayıflar gibi bu hücre içi kalsiyum konsantrasyonu için hassas bir işlemdir. Bu süreçte, de - ve yeniden - differentiation anahtar işaretleri β-myosin ağır zincir (β-MHC), oncostatin M (OSM) ve swiprosin-1 (EFHD2) vardır. Son çalışmalarda kalp re ve de differentiation kültür koşullarda meydana gelen özellikler görüldü vivo içinde kalp tadilat sırasında taklit olduğunu düşündürmektedir. Bu nedenle, yalıtım ve R.V.C ekimi cardiomyocytes Biyoloji anlamada önemli bir rol oynar.

Yetişkin cardiomyocytes kültür: Şekil 1 son yıkandıktan sonra taze izole yetişkin cardiomyocytes 2 h özetini gösterir. Tüm cardiomyocytes yaklaşık % 75'i çubuk şeklinde bir kara delik vardı. Kalan %25 yuvarlak bir morfoloji ve hiçbir tespit sağlam hücre zarı (şekil 1) ile sıradışı bir görünüm gösterdi. Ekimi (6 gün), ilâ sonundaki yayılan, tüm cardiomyocytes % 15 gösterdi yaklaş?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Burada, yalıtım ve yetişkin fare Ventriküler cardiomyocytes (R.V.C) tarımı için bir iletişim kuralı mevcut. İzole R.V.C kısa ve uzun vadeli tarım için kullanılabilir. Yalıtım ve R.V.C ekimi kalp hastalıkları için yeni tedavi rejimlerinin geliştirilmesi önemli bir rol oynayabilir.

Yalıtım ve yetişkin fare Cardiomyocytes tarımı

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

isolation-and-cultivation-of-adult-rat-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Medicine

15.5K Görüntüleme.  Justus Liebig University Giessen. Burada, yalıtım ve yetişkin fare Ventriküler cardiomyocytes (R.V.C) tarımı için bir iletişim kuralı mevcut. İzole R.V.C kısa ve uzun vadeli tarım için kullanılabilir. Yalıtım ve R.V.C ekimi kalp hastalıkları için yeni tedavi rejimlerinin geliştirilmesi önemli bir rol oynayabilir.

Video: Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for &#945;-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.

The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.

İzolasyon ve Neonatal Rat kardiyomiyositlerde Kryoprezervasyon

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

Gelişim Biyolojisi

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Yetişkin Sıçan Kalp miyositler İlköğretim Kültür

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Biyoloji

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

Konfokal Görüntüleme İzolasyon ve Yetişkin kardiyak miyositler Genetik Manipülasyon

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

İzolasyon ve Kültür Yenidoğan Fare kardiyomiyositlerin

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of metabolic syndrome (MetS)-related heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF). The prevalence of MetS-related HFpEF is rising, and atrial cardiomyopathies associated with atrial remodeling and atrial fibrillation are clinically highly relevant as atrial remodeling is an independent predictor of mortality. Studies with isolated single-cell cardiomyocytes are frequently used to corroborate and complement in vivo findings. Circulatory vessel rarefication and interstitial tissue fibrosis pose a potentially limiting factor for the successful single-cell isolation of ACMs from animal models of this disease.
We have addressed this issue by employing a device capable of manually regulating the intraluminal pressure of cardiac cavities during the isolation procedure, substantially increasing the yield of morphologically and functionally intact ACMs. The acquired cells can be used in a variety of different experiments, such as cell culture and functional Calcium imaging (i.e., excitation-contraction-coupling).
We provide the researcher with a step-by-step protocol, a list of optimized solutions, thorough instructions to prepare the necessary equipment, and a comprehensive troubleshooting guide. While the initial implementation of the procedure might be rather difficult, a successful adaptation will allow the reader to perform state-of-the-art ACM isolations in a rat model of MetS-related HFpEF for a broad spectrum of experiments.

Here, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes from a rat model of metabolic syndrome-related heart failure with preserved ejection fraction. A manual regulation of intraluminal pressure of cardiac cavities is implemented to yield functionally intact myocytes suitable for excitation-contraction-coupling studies.

Bir fare modeli Metabolik sendromu ile ilgili kalp yetmezliği ile korunmuş ejeksiyon fraksiyonu atriyal Cardiomyocytes izolasyonu

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

Tıp

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

İzolasyon ve Kültür Yetişkin Fare Hücre Sinyal için kardiyomiyositlerin ve<em&gt; In vitro</em&gt; Kalp hipertrofisi

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde İletimi

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and molecular functional experiments (e.g., contraction, electrophysiology, calcium cycling, etc.) on cardiomyocytes are the gold standard for establishing mechanism(s) of disease. The mouse is the species of choice for functional experiments and the described technique is specifically for the isolation of mouse cardiomyocytes. Previous methods requiring a Langendorff apparatus require high levels of training and precision for aortic cannulation, often resulting in ischemia. The field is shifting toward Langendorff-free isolation methods that are simple, are reproducible, and yield viable myocytes for physiological data acquisition and culture. These methods greatly diminish ischemia time compared to aortic cannulation and result in reliably obtained cardiomyocytes. Our adaptation to the Langendorff-free method includes an initial perfusion with ice-cold clearing solution, use of a stabilizing platform that ensures a steady needle during perfusion, and additional digestion steps to ensure reliably obtained cardiomyocytes for use in functional measurements and culture. This method is simple and quick to perform and requires little technical skill.

The gold standard in cardiology for cellular and molecular functional experiments are cardiomyocytes. This article describes adaptations to the non-Langendorff technique to isolate mouse cardiomyocytes.

Fare kardiyomiyositlerini sürekli olarak izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular mechanisms of cardiovascular disease progression such as cardiac hypertrophy, fibrosis, and atherosclerosis. Although several attempts with variable success have been made to develop immortalized cell lines from the cardiovascular system to understand these cellular mechanisms, primary cells offer a more natural and close to in vivo environment for such studies. Therefore, different laboratories working on a particular cell type have developed protocols to isolate individual types of rat cardiac cells of interest. A protocol that allows the isolation of more than one cell type, however, is missing. Here an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation and enables their use for cellular analyses. This permits the most efficient use of available resources, which may save time and reduce research costs.

Several protocols have been developed and described for the isolation of different cardiac cell types from a rat heart. Here, an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation, reducing the experimental costs.

Bir Yetişkin Sıçan Kalpten Yüksek Kalitede Kardiyomiyosit, Endotel Hücresi ve Fibroblastların Eşzamanlı İzolasyonu

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...