Bu protokol, iki düz kas hücre hattı, miyoepitelyal hücreler ve perisitlerin ayrılmasına ve izole edilmesine olanak sağladığı için önemlidir. Bu yöntem, miyoepitelyal hücre ve perisit popülasyonlarını arındırmak için hücre yüzeyi belirteçleri aracılığıyla düz kas hücrelerinin genetik etiketlemesini birleştirir. Bu protokol, sağlıklı ve hastalıklı miyoepitelyal hücrelerin fonksiyon ve rejeneratif yeteneklerinin karşılaştırılmasını ve gen ekspresyonu çalışmaları için bu hücrelerin işlenmesine olanak sağlar.
Miyoepitelyal hücreler meme gibi diğer ekzokrin bezleri var, tükürük, ve pankreas, hangi bu protokol miyoepitelyal hücreleri ve perisitler izolasyon tarafından adapte sağlar diğer dokulardan. Alfa düz kas aktin veya SMA ifade hücreleri etiketlemek için, iki gün boyunca günde bir kez vücut ağırlığı intraperitoneally 20 gram tamoksifen 100 mikrolitre ile üç ila dört haftalık tamoksifen-indüklemez alfa SMA tahrik muhabir fareler enjekte. Lacrymal bezi toplama için, son enjeksiyondan iki ila üç gün sonra, aynı zamanda bezi serbest etmek için küçük makas keskin ucu ile bezi etrafında bağ dokusu çizerek ise yavaşça bir bezi çekmek için cımbız kullanın.
Lacrymal ve parotis bezleri ayrılmış zaman, akrilik bezi kesmek ve buz üzerinde soğuk PBS iki mililitre ile 35 milimetrelik bir çanak içine bezleri yerleştirmek için makas kullanın. Bir diseksiyon mikroskop altında çanak yerleştirin ve herhangi bir çevreleyen yağ ve bağ dokusu kırpın. Sonra iki forceps ile lacrymal bezi kapsülü çıkarın.
Tüm bezleri hasat edildiğinde, hücre etiketleme onaylamak için bir floresan mikroskop altında doku küçük bir parça kontrol edin. Tek hücreli süspansiyon hazırlamak için, tüm akrilik bezleri oda sıcaklığında sindirim ortamı 0,5 mililitre içeren 35 milimetrelik bir çanağa aktarın ve bezleri 0,2 ila bir mikrometre kare parçalar halinde kıymak için küçük makas kullanın. Geniş delikli pipet filtresi ucu kullanarak kıymalı dokuyu iki mililitrelik yuvarlak alt tüpe aktarın ve tüpteki hacmi sindirim ortamı ile iki mililitreye getirin.
Tüpü karıştırmak için ters çevirin ve tüpü dakikada 100 ila 120 dönüşte 90 dakika boyunca 37 derece santigrat derecesal bir inkübatöre yerleştirin. Her 30 dakikada bir, azalan delik boyutuyla 1000 mikrolitre lik filtre uçlarını kullanarak bezi 20 ila 30 kez yavaşça triturate. Her triturasyonsonunda, kümeler için mikroskop altında 10 mikrolitrelik bir aliquot inceleyin.
90 dakika sonra bir insülin şırınga iğnesi ile daha fazla süspansiyon içine hücreleri serbest bırakmak ve 15 mililitrelik tüp hücre çözeltisi transfer örnek 2-3 kez geçmek. Engelleme Orta Tip 1'i toplam beş mililitreye ekleyin ve tüpü ters çevrilerek 2-3 kez karıştırın. Hücreleri 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir tüpe geçirin ve filtreden hücreleri bir kez daha geçirmeden önce süzgeçi bir mililitre Blokaj Orta Tip 1 ile yıkayın.
Sonraki santrifüj ile hücreleri toplamak ve engelleme Orta Tip 2 engelleme iki mililitre pelet resuspend. Hücreleri iki mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve santrifüj ile hücreleri toplayın. 37 santigrat derece ve dakikada 100-120 dönüşler bir 2-3 dakikalık kuluçka için Accutase çözeltisi bir mililitre hücreleri yeniden askıya.
Kuluçka sonunda, hücreleri 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 10 mililitreye kadar Blokaj Orta Tip 1 ekleyin. Santrifüj den sonra oda sıcaklığında 30 dakikalık bir kuluçka için altı mililitre geri kazanım ortamı hücreleri resuspend. Kuluçka sonunda, tam hücre bölünmesi sağlamak için mikroskop altında 10 mikrolitrelik bir örnek kontrol edin.
Sayma sonra, santrifüj ile hücreleri toplamak. Floresan-aktive Hücre Sıralama, veya FACS için hücreleri leke için, FACS tampon 400 mikrolitre içeren iki mililitre tüp başına beş hücreye beş kata kadar 10 ekleyin ve Brilliant Violet dört 21 anti fare CD326 ve Ghost Red 780 Canlılık Boya 0.5 mikrolitre beş mikrolitre ekleyin. Iyice karıştırdıktan sonra, 4 5 dakikalık bir kuluçka için folyo ile tüpleri sarın 4 derece santigrat rotasyon ile.
Kuluçka sonunda, santrifüj ile hücreleri toplamak ve örnek başına FACS tampon bir mililitre pelet resuspend. Hücre örneklerini buz üzerinde tek tek beş mililitrelik FACS tüplerine aktarın ve tek renk kontrolleri kullanarak telafiyi ayarlayın. Sonra hücreleri inç kare başına 20 pound'da 100 mikrometrelik bir memeden ayırın.
Mikrovasküler perisitler kılcal damarların duvarları etrafında gelişir ve kare şekli gösterir. Miyoepitelyal hücreler akrilik salgı acini çevreleyen, uzun süreçler var, ve nispeten geniş bir alanı işgal. Burada, floresan aktive Hücre Sıralama için hazırlık bir lacrymal bezinden ayrışmış hücreler, sadece gösterildiği gibi, gösterilir.
Miyoepitelyal hücrelerin ve perisitlerin akış sitometrik sıralaması için hücreler, herhangi bir doublethariç önce önce ileri ve yan dağılım alanları tarafından geçitlenmelidir. Ölü hücreleri dışlamak için gating sonra, kontrol örnekleri arka plan gürültü belirlemek ve sinyaller arasında optimum bir ayrım için uygun bir tazminat kurmak için kullanılır. Protokolde açıklandığı gibi bezlerin sayısını ve sindirim orta hacimli tutmak için unutmayın, ve tüm adımları doku sindirim verimliliğini kontrol etmek için.
İzole hücreler in vivo/in vitro deneyler, örneğin hücre kültürü, transplantasyon, metabolomik, proteomik ve tek hücreanalizi dahil olmak üzere birden fazla downstream uygulaması için kullanılabilir.
