Yazarlar ucsf Kaynak Tahsis Programı tarafından sağlanan fon kabul etmek istiyorum.

Tüm hayvan çalışmaları Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu önerilere sıkı göre altında yapıldı. Protokol California Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC), San Francisco tarafından onaylandı. 1. Fare Embriyonik Gözyaşı bezleri (LG): Hasat ve Mikrodiseksiyon <ol><li> Bilimsel Araştırma Etik komite için Kurumsal Hayvanlar tarafından onaylanan prosedürleri takiben uygun embriyonik günde hasat embriyolar servikal dislokasyon tarafından onaylanması ardından, yükselen CO 2 inhalasyon ile hamile CD-1 (veya transgenik) kadın aşımına euthanize. Vajinal fiş keşif e0&#39;ın gün belirleyin. Not: Gözyaşı bezleri (Lgs) itibaren e14 tek tomurcuk aşamasından hasat edilebilir. Ancak, e16 (5-10 tomurcukları) embriyolar ex vivo kültür için en tutarlı sonuçlar verir. </li><li> V sterilize% 70 etanol kullanılarak fare Entral tarafında. Cildi çimdik ve steril cerrahi makas ile orta hatta bir kesi yapmak; deri yoluyla kesilmiş ve karın boşluğuna maruz periton. 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiş Her bir uterusa ve yerine soğuk PBS (fosfat tamponlu salin) ya da DMEM F12 ortamında üstündeki mesometrium boyunca keserek 2 rahim boynuzları çıkarın. </li><li> Forseps kullanarak (# 5), amnion kesesi embriyolar çıkarın ve soğuk PBS içeren ikinci bir steril Petri kabı içine yerleştirin. Gözleri veya kafa alana dokunmayın dikkatli olun. </li><li> Bir transillüminasyonu tabanı ile bir mikroskop üzerine embriyo yerleştirin. 1.7 - embriyo &lt;E17 ise, adımları 1.5 gerçekleştirin. Embriyolar iseniz&gt; E17, bu adımlar bu nedenle 1.8 adıma geçin, faydalı olabilir, ancak şart değildir. </li><li> Sadece alt çene altındaki gövde (aşama 1, şekil 2) &#39;deki Bağın gelen kafa Severga steril neşter (# 10 bıçak). Mandibula diseksiyon plaka üzerinde şimdi böylece başını döndürün. Kafa ve yaklaşık ¼ beyin (adım 2, 1. kesim, Şekil 2) dorsal tarafına kaldırmak için bir neşter stabilize forseps kullanın - Bu kıkırdak e15 etrafında stiffens kez özellikle önemlidir. </li><li> Neşter gözler arasındaki burun delmek böylece başını döndürün. Gözleri ayrı yarımları (aşama 2, 2. kesme, Şekil 2) artık demektir ki, başlığın merkezinden geçen bir kesim yapın. </li><li> İki # 5 forseps kullanarak, başın bir yarısını almak ve aşırı doku (Şekil 2 adım 3) çıkarın. (Gözün alt arka köşede bulunur) LG bu kaldırma işlemi kayıp değil bu yüzden başını yönlendirmek için emin olun. Fazlalığı serebral, kıkırdak ve burun çevresindeki doku ve gözün altında çıkarın. Bezi bu noktada zor görünür olduğundan, doğru aşırı doku kaldırma t sonra yönlendirilmiş gözü sağlamako LG konumunu kaybetmemek. </li><li> Dikkatle posterior, hem forseps ile göz alt köşesinde cildi kapmak. Dikkatle LG maruz forseps ile açık çekerek cildi çıkarın. LG görselleştirmek yardımcı olmak için doku altında ve üstünde ek aydınlatma kullanın. Not: LG, koyu, yoğun mezenşimin içinde bir kanal üzerinde bir tomurcuk olarak görünüm ile ayırt, bu noktada görünür olmalıdır. </li><li> Dikkatle LG ve ilgili mezenşimi LG veya ilişkili kanalı kapmak için dikkatli olmak, forseps kullanarak uzak çevreleyen dokudan (diyagram ve görüntüler bakın) incelemek başlar. Bezi çevreleyen dokudan serbest sonra, yavaşça LG kanalının dibinde gözünü çevreleyen epitel kavrayarak tüm bezini çıkarın. Yoğunlaştırılmış bir mezenşimin içine epitel invaginates olarak görülebilir epiteli çevreleyen mezenşimi korumak için özen gösterin. Not: Tissu&#39;dan bazı ilave gerie (herhangi bir küçük kemik fragmanları, kas ve bağ doku) komşu / büyüme faktörü sinyal önlemek için gerekli olabilir. </li><li> Kültür, hasat 4 - 5 bezleri ve plaka başına ilişkili mezenşimin (Lgs hemen diseksiyon üzerine ekilir); RT-PCR 6 RNA lisis tampon 100 ul başına 14 bezlerinin en az toplamak. </li></ol> 2. ex vivo Kültür Plakaları hazırlayın Bu prosedür, gelişmekte olan tükürük bezi 7,8 için kullanılana dayanır. <ol><li> Cam tabanlı bir 50 mm çaplı bir mikro çanak 7 50 ug / ml, askorbik asit ve 50 ug / ml holo-transferrin ile birlikte kültür ortamı (100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiş), DMEM F12 200 ul ekle. Not: Daha önce embriyonik tükürük bezinde morfogenetiğine maksimize etmek için bunu buldum DMEM F12 seçildi. </li><li> 13 mm POLYCARB Floatmedyanın üstüne 0.1 mikron gözenekleri ile onat membran filtre. </li><li> İsteğe bağlı Adım: 3 mg / ml&#39;lik bir son konsantrasyon sağlamak için DMEM / F12 ile 1 (hafifçe karıştırmak için, 200 ul pipet kullanın, santrifüj 1 dakika boyunca kabarcıklar görüldüğünde): 3-D laminin 1 seyreltin. Ekle Bu 15 ul filtre 3-D laminin seyreltilmiş. Not: Bu seyreltme epitel dallanma ödün vermeden, 3B durumda LG muhafaza edilmesi için uygun olduğu bulunmuştur. Bununla birlikte, LG&#39;nin kültürü için gerekli değildir. </li><li> Filtrenin üzerine ya da laminin içine 5 LG - 4 yerleştirin. Kültür Lgs ex vivo olarak 24 - 48 saat (Şekil 3) veya 20 qPCR daha fazla analiz için dk ya da immüno-boyama (Şekil 4)% 4 PFA ile yapışması. Embriyonik glandüler doku QPCR analizi için, Rebustini ark bakın., 2011. Embriyonik bez dokularında imüno-analizi için aşağıdaki alıntılarda bakınız: Hoffman ve arkadaşları, (2002), Steinberg ör.T ve arkadaşları., (2005). </li></ol> 3. Fare Postnatal ve Erişkin Gözyaşı bezleri (LG): Diseksiyon <ol><li> Uygun hayvan etik komitenin standartlarına göre doğum sonrası fareyi euthanize. Doğum sonrası yavrular gün 8 ya da daha genç, steril makas ile kafa kesilmesinin euthanize. Doğum sonrası gün 8 veya üzeri için,% 70 etanol ile kürk sprey. </li><li> LG bulmak için, fare yukarıdan aydınlatma ile bir mikroskop altında yan yanal yatıyordu. Not: doğum sonrası ve yetişkin LG karotid arter, masseter kas ve dermis (Şekil 5) ile çevrelenmiştir. </li><li> Küçük diseksiyon makas kullanarak, yanal LG nerede olması gerektiğini Epidermisteki küçük bir kesi yapmak. </li><li> Forseps kullanarak, LG maruz kulak doğru epidermis çekerek açın. </li><li> Yavaşça çevreleyen dokudan LG gevşetmek için forseps kullanın. </li><li> LG çevreleyen dokudan serbest bırakıldıktan sonra, dikkatli, kanal tarafından LG kaldırmakkanal ve göz çevresindeki epitel (Şekil 1) bağlamak nerede kavrama tarafından. </li><li> RT-PCR için RNA, liziz tamponu içinde LGS yerleştirin veya immün için 20 dakika boyunca% 4 PFA ile yapışması. </li></ol>

<ol>
	<li>Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+keratoconjunctivitis+sicca.">Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca.</a> Current allergy and asthma reports. 14, 403 (2014).</li><li>Makarenkova, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF10+is+an+inducer+and+Pax6+a+competence+factor+for+lacrimal+gland+development.">FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development.</a> Development. 127, 2563-2572 (2000).</li><li>Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+regulation+of+lacrimal+gland+secretory+processes:+relevance+in+dry+eye+diseases.">Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases.</a> Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).</li><li>Nigam, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+can+the+intrinsic+power+of+branching+morphogenesis+be+used+for+engineering+epithelial+tissues+and+organs.">Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs.</a> Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).</li><li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosaminoglycan-dependent+restriction+of+FGF+diffusion+is+necessary+for+lacrimal+gland+development.">Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development.</a> Development. 139, 2730-2739 (2012).</li><li>Rebustini, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MT2-MMP-dependent+release+of+collagen+IV+NC1+domains+regulates+submandibular+gland+branching+morphogenesis.">MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental cell. 17, 482-493 (2009).</li><li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Profiles+of+Mouse+Submandibular+Gland+Development:+FGFR1+Regulates+Branching+Morphogenesis+in+Vitro+Through+BMP-+and+FGF-Dependent+Mechanisms.">Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms.</a> Development. 129, 24-5778 (2002).</li><li>Steinberg, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2b+signaling+regulates+ex+vivo+submandibular+gland+epithelial+cell+proliferation+and+branching+morphogenesis.">FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis.</a> Development. 132, 1223-1234 (2005).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. 329, 1645-1647 (2010).</li><li>Magenheim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+restrain+pancreas+branching,+differentiation+and+growth.">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, 4743-4752 (2011).</li><li>Jaskoll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF10/FGFR2b+signaling+plays+essential+roles+during+in+vivo+embryonic+submandibular+salivary+gland+morphogenesis.">FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis.</a> BMC developmental biology. 5, 11 (2005).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney.">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+stimulation+improves+epithelial+organ+regeneration.">Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration.</a> Nature communications. 4, 1494 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Kültürüne çok yönlülük ve LG ex vivo gelişimini incelemek için önemli avantajlar sağlamaktadır manipüle. Bu araştırmacı hipotezleri ve nöronal, endotelyal ve mezenkimal hücreler organı oluşturacak nasıl etkileşimde epitel değerlendirmek için yapılabilir pertürbasyonların sayıda test edebilir hızını içerir. Bu modeli kullanarak, ancak, uyarılar bir dizi bulunmaktadır. İlk olarak, izolasyon sayesinde bezi sırada artık sinirler veya kan damarlarının 9,10 tarafında...

Gözyaşı bezi (LG) görme keskinliği ve sağlık, bakım ve göz yüzeyinin hücrelerinin korunması için kritik sulu gözyaşı salgılanmasından sorumludur. Batma, ışık duyarlılığı ile karakterize ve vizyonunu 1 azalır sulu eksik Kuru Göz Hastalığı: En sık ve zayıflatıcı göz bozuklukları birinde LG disfonksiyon sonuçları. İnsanda LG gözün lateral ucunda yukarıdaki yörüngede bulunduğu yeri 3 - oküler yüzey üzerine 5 boşaltım kanalları mevduat gözyaşları. Fare büyük göz bezlerinin üç çift, çoğu çalışılan tek bir boşaltım kanalı yoluyla göze seyahat gözyaşları ile kulak (exorbital) için gözyaşı bezi (LG) bulunduğu ön ve ventral olduğunu. Diğer glandular organlara benzer şekilde, LG, yoğunlaştırılmış mezenşim içinde tek bir epitel tomurcuk birden tomurcuğu mermi ve talimat için oluk oluşumu maruz kalmakta ve epitel dallanma morfojenezinin sürecinde gelişir(Şekil 1) salgılama asinüs ve kanalların karmaşık bir birbirine birleşik ağ m 2. Gelişimi sırasında epitel vaskülare olur yanı olarak ağır şekilde üstün servikal ganglion 3 sempatik sinirler tarafından pterigopalatin ganglion parasempatik sinirler tarafından ve daha az bir ölçüde innerve. Türleri nöronal, epitel, endotel ve mezenkimal hücreler yani bu hücrelerin her biri arasındaki etkileşimleri, işlevi ve yetişkin doku bakımı için gereklidir. Ancak, arası hücre tipi iletişim bu süreçleri kılavuzları nasıl yanı sıra LG gelişimini ve yenilenmesini koordine yatan moleküler mekanizmalar belirsizdir. Embriyonik ex vivo kültür tekniklerinin ortaya çıkışı, çok dallanmış organ 4 gelişimsel ve rejeneratif yolların belirlenmesi izin vermektedir. Ex vivo kültürlenmesiyle araştırmacıya (beni organı manipüle yeteneği verirchanical, genetik veya kimyasal) tanımlanmış koşullar altında yanı sıra gerçek zamanlı organ gelişimi ve hücre-hücre etkileşimleri karakterize etmek. Farenin exorbital LG, bu tekniğin son derece müsait olduğunu ve son çalışmalar gelişimini 2,5 düzenleyen sinyalizasyon sistemi tanımlamıştır. Ancak, LG gelişimini ve yenilenmesini destekleyen moleküler ipuçlarını anlamak için ihtiyaca rağmen, şu anda büyük olasılıkla nedeniyle organın izole teknik zorluklar, ilgili yeterli kalır. Bu yazıda, izole ve gelişim programları tanımlamak için embriyonik fare LG ex vivo kültürünü gerçekleştirmek için nasıl açıklar.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 without HEPES</td><td>SH3027101</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>P0781</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Albumin solution from bovine serum</td><td>A9576</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% Solution</td><td>15710</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Diluted to 4% in 1x PBS</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 10x</td><td>BP665-1</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 1x</td><td></td><td></td><td>Prepared from 10x stock</td></tr><tr><td>holo-Transferrin bovine</td><td>T1283</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25&amp;nbsp;mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50&amp;nbsp;&amp;mu;g/ml.</td></tr><tr><td>L-ascorbic acid (Vitamin C)</td><td>A4544</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25&amp;nbsp;mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50&amp;nbsp;&amp;mu;g/ml.</td></tr><tr><td>BioLite 100 mm Tissue Culture Treated Dishes</td><td>130182</td><td>Thermo Scientific</td><td>Non-tissue culture-treated plates can also be used.</td></tr><tr><td>Stereo Microscope with substage iluminator</td><td>Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss</td><td>Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.</td></tr><tr><td>Substage Illuminator Base for Stereo Microscope</td><td>TLB 4000</td><td>Diagnostics Instruments, Inc.</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35&amp;nbsp;mm Tissue Culture Treated Dishes</td><td>353001</td><td>Corning</td><td>Non-tissue culture-treated plates can also be used.</td></tr><tr><td>50 mm uncoated glass bottom dishes</td><td>P50G-1.5-14-F</td><td>MatTek Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Widefield fluorescence microscope</td><td>Axio Observer Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td>Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera.</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td>Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.</td></tr><tr><td>SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2&amp;nbsp;cm)</td><td>17-305X</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td>Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.</td></tr><tr><td>Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11&amp;nbsp;cm)</td><td>91150-20</td><td>Fine Science Tools (USA), Inc.</td><td>Ideal for harvesting glands from embryos.</td></tr><tr><td>Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3.</td><td>4-30</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10</td><td>4-310</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit</td><td>AM1931</td><td>Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I</td><td>3446-005-01</td><td>Trevigen</td><td>6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12</td></tr><tr><td>Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice</td><td></td><td>Charles River Labs</td><td>Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0).</td></tr><tr><td>Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1&amp;nbsp;&amp;mu;m pore size, 13&amp;nbsp;mm</td><td>110405</td><td>Whatman</td><td></td></tr><tr><td>Timed-pregnant Pax6-Cre, GFP mice</td><td>Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Optional mice for learning how to locate the LG.</td></tr></tbody></table>

manipulating the murine lacrimal gland

Gözyaşı bezi (LG) korneanın yapısını ve işlevini, görme için gerekli şeffaf bir doku korumak için gerekli sulu gözyaşı salgılar. 5 kanallar - insanda bir tek LG 3 ile oküler yüzeye gözyaşları veren her gözün lateral ucunda yukarıdaki yörüngede bulunur. Fare büyük göz bezlerinin üç çift, çoğu okudu kulağına exorbital gözyaşı bezi (LG) bulunduğu ön ve ventral olduğunu. Diğer glandular organlara benzer şekilde, LG, yoğunlaştırılmış mezenşim içinde tek bir epitel tomurcuk salgılama asinüs ve kanalların karmaşık bir birbirine birleşik bir şebekenin oluşturulması için tomurcuk ve kanal formasyonu birçok kere maruz kalmakta ve epitel dallanma morfojenezinin sürecinde gelişir. Bu ayrıntılı süreci iyi gibi pankreas ve tükürük bezi gibi diğer birçok epitelyal organlarda belgelenmiştir. Bununla birlikte, LG daha az araştırılmıştır ve morfojenezini kontrol eden mekanizmalar zayıf biçimde altındadırdurdu. Biz bir model sistem olarak bu altında temsil bulma diseksiyon ve LG kültürleme ile ilişkili zorluklar bir sonucu olduğunu sanıyorum. Bu nedenle, burada diseksiyon hasat embriyonik ve doğum sonrası LG için teknikler ve doku ex vivo kültür için yöntemleri tarif eder.

LG epitel dallanma morfojenezinin sürecinde gelişir. E14, e15, E16, E17, ve P2 disseke embriyonik LGS aydınlık görüntüler bu olay göstermektedir. <img alt="Şekil 1," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51970/51970fig1highres.jpg" width="600" /> Şekil 1. LG morfogenetiğine dallanma epitel sürecinde gelişir. Taze e14, e15, E16, E17 ve P2 disseke embriyonik LGS aydınlık görüntüler. <a href="https://www.jove....

Watch this Scientific Journal Video about Manipulating the Murine Lacrimal Gland at JoVE.com

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

Gözyaşı bezi (LG) vizyon ve göz sağlığını korumak için gerekli gözyaşının sulu bileşenlerini üreten bir dallanma organdır. Burada LG gelişiminde rol oynayan sinyal yolları deşifre üzere kemirgen LG diseksiyonu ve ex vivo kültür teknikleri açıklar.

Kemirgen Gözyaşı bezi kurgulama

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Research

JoVE Journal

Biology

20.8K Görüntüleme.  University of California San Francisco.  Gözyaşı bezi (LG) vizyon ve göz sağlığını korumak için gerekli gözyaşının sulu bileşenlerini üreten bir dallanma organdır. Burada LG gelişiminde rol oynayan sinyal yolları deşifre üzere kemirgen LG diseksiyonu ve ex vivo kültür teknikleri açıklar. 

Video: Manipulating the Murine Lacrimal Gland

A Rabbit Model of Aqueous-Deficient Dry Eye Disease Induced by Concanavalin A Injection into the Lacrimal Glands: Application to Drug Efficacy Studies

Dry eye disease (DED), a multifactorial inflammatory disease of the ocular surface, affects 1 in 6 humans worldwide with staggering implications for quality of life and health care costs. The lack of informative animal models that recapitulate its key features impedes the search for new therapeutic agents for DED. Available DED animal models have limited reproducibility and efficacy. A model is presented here in which DED is induced by injecting the mitogen concanavalin A (Con A) into the orbital lacrimal glands of rabbits. Innovative aspects of this model are the use of ultrasound (US) guidance to ensure optimal and reproducible injection of Con A into the inferior lacrimal gland; injection of Con A into all orbital lacrimal glands that limits compensatory production of tears; and use of periodic repeat injections of Con A that prolong the state of DED at will. DED and its response to test agents are monitored with a panel of parameters that assess tear production, the stability of the tear film, and the status of the corneal and conjunctival mucosa. They include tear osmolarity, tear break-up time, Schirmer&#39;s tear test, rose bengal staining, and tear lactoferrin levels. The induction of DED and the monitoring of its parameters are described in detail. This model is simple, robust, reproducible, and informative. This animal model is suitable for the study of tear physiology and of the pathophysiology of DED as well as for the assessment of the efficacy and safety of candidate agents for the treatment of DED.

This article describes the development of a method to induce acute or chronic dry eye disease in rabbits by injecting concanavalin A to all portions of the orbital lacrimal gland system. This method, superior to those already reported, generates a reproducible, stable model of dry eye suitable for the study of pharmacological agents.

Kıprimal Bezlere Concanavalin A Enjeksiyonu ile Indüklenen Sulu-Eksik Kuru Göz Hastalığının Tavşan Modeli: İlaç Etkinliği Çalışmalarına Uygulama

Dry eye disease (DED), a multifactorial inflammatory disease of the ocular surface, affects 1 in 6 humans worldwide with staggering implications for ...

Tıp

Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic step. Despite advances in our understanding of DED, significant knowledge gaps remain. Advances are limited in part due to the lack of informative animal models. The authors recently reported on a method of DED induced by injecting all orbital lacrimal gland (LG) tissues with the lectin concanavalin A. Here, we report a novel model of aqueous-deficient DED based on the surgical resection of all orbital LG (dacryoadenectomy) tissues. Both methods use rabbits because of their similarity to human eyes in terms of the size and structure of the ocular surface. One week after removal of the nictitating membrane, the orbital superior LG was surgically removed under anesthesia, followed by removal of the palpebral superior LG, and finally removal of the inferior LG. Dacryoadenectomy induced severe DED, evidenced by a marked reduction in the tear break up time test and the Schirmer&#39;s tear test, and significantly increased tear osmolarity and rose bengal staining. Dacryoadenectomy-induced DED lasted at least eight weeks. There were no complications and animals tolerated the procedure well. The technique can be mastered relatively easily by those with adequate surgical experience and appreciation of the relevant rabbit anatomy. Since this model recapitulates the features of human aqueous-deficient DED, it is suitable for studies of ocular surface homeostasis, DED, and candidate therapeutics.

A novel approach is presented to induce chronic dry eye disease in rabbits by surgically removing all orbital lacrimal glands. This method, distinct from those previously reported, produces a stable, reproducible model of aqueous deficient dry eye well suited to study tear physiology and pathophysiology and ocular therapeutics.

Tavşanlarda Komple Dakriyoadenektomi Kullanarak Şiddetli Kuru Göz Modelinin Oluşturulması

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic ...

Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ductal epithelial, and myoepithelial cells (MECs). MECs express alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) and have a contractile function. They are found in multiple glandular organs and are of ectodermal origin. In addition, the LG contains SMA+ vascular smooth muscle cells of endodermal origin called pericytes: contractile cells that envelop the surface of vascular tubes. A new protocol allows us to isolate both MECs and pericytes from adult murine LGs and submandibular glands (SMGs). The protocol is based on the genetic labeling of MECs and pericytes using the SMACreErt2/+:Rosa26-TdTomatofl/fl mouse strain, followed by preparation of the LG single-cell suspension for fluorescence activated cell sorting (FACS). The protocol allows for the separation of these two cell populations of different origins based on the expression of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) by MECs, whereas pericytes do not express EpCAM. Isolated cells could be used for cell cultivation or gene expression analysis.

The lacrimal gland (LG) has two cell types expressing &#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA): myoepithelial cells (MECs) and pericytes. MECs are of ectodermal origin, found in many glandular tissues, while pericytes are vascular smooth muscle cells of endodermal origin. This protocol isolates MECs and pericytes from murine LGs.

Yetişkin Murine lacrimal ve submandibular bezlerden Myoepitelyal hücrelerin izolasyonu

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...

Biyoloji

Sıçanlarda Skopolaminin İndüklediği Lakrimal Bez Disfonksiyonu

A Rat Dry Eye Model with Lacrimal Gland Dysfunction Induced by Scopolamine

Aqueous-deficient dry eye (ADDE) is a type of dry eye disease that can result in the reduction of tear secretion quantity and quality. Prolonged abnormal tear production can lead to a disturbance in the ocular surface environment, including corneal damage and inflammation. In severe cases, ADDE can cause vision loss or even blindness. Currently, dry eye treatment is limited to eye drops or physical therapy, which can only alleviate eye discomfort symptoms and cannot fundamentally cure dry eye syndrome. To restore the function of the lacrimal gland in dry eye, we have created an animal model of lacrimal gland dysfunction in rats induced by scopolamine. Through the comprehensive evaluation of the lacrimal gland, corneas, conjunctivas, and other factors, we aim to provide a full understanding of the pathological changes of ADDE. Compared with the current dry eye mouse model, this ADDE animal model includes a functional evaluation of the lacrimal gland, providing a better platform for studying lacrimal gland dysfunction in ADDE.

Yazar Spotlight: Kuru Göz Hayvan Modelleri Geliştirmedeki Zorluklar ve Gelecekteki Araştırma Yönleri

Here, we establish a rat model of lacrimal gland dysfunction to provide a basis for the study of aqueous-deficient dry eye.

Skopolamin Kaynaklı Gözyaşı Bezi Disfonksiyonu Olan Bir Sıçan Kuru Göz Modeli

Aqueous-deficient dry eye (ADDE) is a type of dry eye disease that can result in the reduction of tear secretion quantity and quality. Prolonged abnormal ...

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture method to obtain a sufficient number of LG stem cells (LGSCs) is one obstacle for further research and application. The three-dimensional (3D), serum-free culture method for adult mouse LGSCs is well established and shown here. The LGSCs could be continuously passaged and induced to differentiate to acinar or ductal-like cells.
For the LGSC primary culture, the LGs from 6-8-week-old mice were digested with dispase, collagenase I, and trypsin-EDTA. A total of 1 &#215; 104 single cells were seeded into 80 &#181;L of matrix gel-lacrimal gland stem cell medium (LGSCM) matrix in each well of a 24-well plate, precoated with 20 &#181;L of matrix gel-LGSCM matrix. The mix was solidified after incubation for 20 min at 37 &#176;C, and 600 &#181;L of LGSCM added.
For LGSC maintenance, LGSCs cultured for 7 days were disaggregated into single cells by dispase and trypsin-EDTA. The single cells were implanted and cultured according to the method used in the LGSC primary culture. LGSCs could be passaged over 40 times and continuously express stem/progenitor cell markers Krt14, Krt5, P63, and nestin. LGSCs cultured in LGSCM have self-renewal capacity and can differentiate into acinar or ductal-like cells in vitro and in vivo.

The three-dimensional, serum-free culture method for adult lacrimal gland (LG) stem cells is well established for the induction of LG organoid formation and differentiation into acinar or ductal-like cells.

Lakrimal Bez Kök Hücreleri için Üç Boyutlu, Serumsuz Kültür Sistemi

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...

Establishment of A Mouse Model of Aqueous Deficiency Dry Eye

Dry eye disease is a prevalent condition affecting 5%-50% of the global population. Animal model investigations play a crucial role in understanding its underlying mechanisms. Therefore, we developed a mouse model of dry eye disease by surgically removing both the extraorbital lacrimal glands (ELG) and intraorbital lacrimal glands (ILG) to investigate the ocular surface pathology in the context of aqueous deficiency dry eye. Two weeks post operation, the mice exhibited severe dry eye manifestations, including reduced tear secretion, corneal epithelial irregularities, positive fluorescein sodium staining, and neovascularization. Histological examination via hematoxylin and eosin staining revealed inflammatory cell infiltration and corneal epithelium dysplasia. Immunofluorescence staining and quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction revealed decreased expression of the normal corneal epithelial biomarkers K12 and Pax6 and increased expression of Sprr1b in the corneal epithelium. These ocular manifestations indicated abnormal corneal epithelial differentiation. Furthermore, immunofluorescence staining of Ki67 revealed the increasing cell proliferation. In conclusion, the ELG plus ILG excision model proved suitable for studying changes in the ocular surface and elucidating the mechanisms underlying aqueous deficiency dry eye.

Here, we present a method to establish a mouse model of aqueous-deficient dry eye by excising the extraorbital and infraorbital lacrimal glands and evaluate the changes in the ocular surface in aqueous deficiency dry eye.

Dry eye disease is a prevalent condition affecting 5%-50% of the global population. Animal model investigations play a crucial role in understanding its ...

Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from desiccation stress and external insults. Little is known about lacrimal gland (patho)physiology because of the lack of adequate in vitro models. Organoid technology has proven itself as a useful experimental platform for multiple organs. Here, we share a protocol to establish and maintain mouse and human lacrimal gland organoids starting from lacrimal gland biopsies. By modifying the culture conditions, we enhance lacrimal gland organoid functionality. Organoid functionality can be probed through a "crying" assay, which involves exposing the lacrimal gland organoids to selected neurotransmitters to trigger tear release in their lumen. We explain how to image and quantify this phenomenon. To investigate the role of genes of interest in lacrimal gland homeostasis, these can be genetically modified. We thoroughly describe how to genetically modify lacrimal gland organoids using base editors-from guide RNA design to organoid clone genotyping. Lastly, we show how to probe the regenerative potential of human lacrimal gland organoids by orthotopic implantation in the mouse. Together, this comprehensive toolset provides resources to use mouse and human lacrimal gland organoids to study lacrimal gland (patho)physiology.

This protocol describes how to establish, maintain, genetically modify, differentiate, functionally characterize, and transplant lacrimal gland organoids derived from primary mouse and human tissue.

Fare ve İnsan Lakrimal Bezi Organoidlerinin Kurulması, Bakımı, Farklılaşması, Genetik Manipülasyonu ve Transplantasyonu

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

Superior Lacrimal Gland Removal: A Surgical Technique to Remove the Palpebral and Orbital Parts of Superior Lacrimal Gland from Rabbit Model

Source: Honkanen, R. A. et al., <a href="https://www.jove.com/v/60126">Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video describes the surgical procedure to remove the two parts: palpebral and orbital of the superior lacrimal gland from a rabbit to create a dry eye disease model. This rabbit model is suitable for studies of ocular surface homeostasis, pathophysiology and ocular therapeutics.

Superior Lakrimal Bezin Çıkarılması: Superior Lakrimal Bezin Palpebral ve Orbital Kısımlarının Tavşan Modelinden Çıkarılması İçin Cerrahi Bir Teknik

Source: Honkanen, R. A. et al., Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits. J. Vis. Exp. (2020).
This video ...

Kemirgen Gözyaşı bezi kurgulama

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kıprimal Bezlere Concanavalin A Enjeksiyonu ile Indüklenen Sulu-Eksik Kuru Göz Hastalığının Tavşan Modeli: İlaç Etkinliği Çalışmalarına Uygulama

Tavşanlarda Komple Dakriyoadenektomi Kullanarak Şiddetli Kuru Göz Modelinin Oluşturulması

Yetişkin Murine lacrimal ve submandibular bezlerden Myoepitelyal hücrelerin izolasyonu

Skopolamin Kaynaklı Gözyaşı Bezi Disfonksiyonu Olan Bir Sıçan Kuru Göz Modeli

Skopolamin Kaynaklı Gözyaşı Bezi Disfonksiyonu Olan Bir Sıçan Kuru Göz Modeli

Skopolamin Kaynaklı Gözyaşı Bezi Disfonksiyonu Olan Bir Sıçan Kuru Göz Modeli

Lakrimal Bez Kök Hücreleri için Üç Boyutlu, Serumsuz Kültür Sistemi

Establishment of A Mouse Model of Aqueous Deficiency Dry Eye

Fare ve İnsan Lakrimal Bezi Organoidlerinin Kurulması, Bakımı, Farklılaşması, Genetik Manipülasyonu ve Transplantasyonu

Superior Lakrimal Bezin Çıkarılması: Superior Lakrimal Bezin Palpebral ve Orbital Kısımlarının Tavşan Modelinden Çıkarılması İçin Cerrahi Bir Teknik