Bu protokol, hücre altı protein ubiquitination düzeyleri ve kemirgen beyin proteozom aktivitesi ölçüyor nasıl hücresel aktivite, öğrenme, ya da hastalığa yanıt olarak ubikitin-proteozom aktivite değişiklikleri konular içinde karşılaştırmalar içinde izin. Protokol aynı kemirgen beyinden sinaptik, sitoplazmik ve nükleer fraksiyonların toplanmasına izin verir. Kaybı en aza indirmek, küçük doku miktarları ve temel laboratuvar ekipmanları ile yapılabilir.
Prosedürü gösteren Taylor McFadden, benim laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olacak. Metin protokolünde açıklandığı gibi kemirgen beyin dokusunun toplanması ve diseksiyonu ile bu prosedüre başlayın. Kullanılan yarımkürenin her deney grubu için ekstraksiyon koşulları arasında dengelendiğinden emin olun.
Eksi 80 derece santigrat dondurucu ilgi bölgenin bir yarımküreiçeren 1.5 mililitrelik centrifuge mikrotüp çıkarın. Neşter kullanarak donmuş beyin dokusunu iki mililitrelik cam Teflon homogenizer'e aktarın. Teflon tüpüne 500 mikrolitre lysis tamponekleyin.
B noluba kullanarak, görünür miktarda katı madde bulununa kadar aynı dokuyu 15 vuruşla homojenize edin. Her vuruş sırasında bir dönüş hareketi kullanın. 1,000 mikrolitrelik pipetile homojenize numuneyi yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Tüpü ıslak buzüzerine yerleştirin ve 30 dakika kuluçkaya yatırın. Mikrocentrifuge tüp yerleştirin ve dört santigrat derece 845 kez g 10 dakika spin. Tamamlandıktan sonra, dikkatle pipetleme tarafından supernatant çıkarın ve yeni bir 1.5 mililitremikrosantrifüj tüp içine yerleştirin.
Bu sitoplazmik fraksiyon. Elde edilen pelet için ekstraksiyon tampon 50 mikrolitre ekleyin ve pipetleme ile resuspend. Peleti girdap etmeyin.
Yeniden askıda pelet içeren tüpü buzüzerine yerleştirin ve 30 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra 21, 456 kez dört derece santigrat g 20 dakika boyunca tüp santrifüj. Santrifüjden sonra, pipetleme ile supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
Bu nükleer kesir. Daha önce olduğu gibi ilgi bölgesinin bir yarımküresini homojenize etmek dışında 500 mikrolitre TEVP tamponu yerine lysis tamponu kullanın. 1,000 mikrolitrelik pipet kullanarak, homojenize numuneyi yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Numuneyi 1,000 kez g'de 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin. Supernatant toplamak ve 1,000 mikrolitrelik pipet kullanarak yeni bir 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp aktarın. Numuneyi 10,000 kez g'de 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin.
Çekirdekleri ve büyük enkaz içeren orijinal pelet atın. Supernatant'ı yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpe aktarın. Bu sitosolik kesir.
Pelete 50 mikrolitre homojenizasyon tamponu ekleyin ve katı madde görünmeyene kadar pipetleme ile yeniden askıya alın. Numuneyi 20,000 kez 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin. Supernatant'ı yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpe aktarın.
Bu ham sinaptozomal membran fraksiyonu. Tazyiki ayarlamak için plaka okuyucuyu 37 dereceye ısıtın ve koşuboyunca tutun. Uyarmayı 360 nanometreye, emisyonise 460 nanometreye ayarlayın.
Kullanılan 96 iyi plaka sıyrıksa, optik konumu dibe doğru ayarlayın. Koyu bir 96 kuyu plakası kullanılırsa, optik konumu en üste ayarlayın. Her 30 dakikada bir iki saatlik bir tarama süresi yle bir kinetik çalışma programı.
13,5 mililitre ultra saf su ile kitinde sağlanan 20S 10X titreşme tamponu yeniden oluşturun. Şimdi 1X tampon 100 milimolar ATP 14 mikrolitre ekleyin. Bu önemli ölçüde örneklerde proteozom aktivitesini artırır ve test güvenilirliğini artırır.
100 mikrolitre DMSO ile kitte sağlanan AMC standardını yeniden oluşturun. Standart ışığa duyarlı olduğu için karanlıkta veya düşük ışık koşullarında AMC standardını kullanarak adımlar atın. Yüksek ten düşük AMC konsantrasyonlarına kadar standart bir AMC eğrisi oluşturun.
Bu eğri, homojenize numunelerde plaka okuyucu kalibrasyonu ve proteozom aktiviteanalizi için kullanılacaktır. 65 mikrolitre DMSO ile kitte sağlanan proteozal subtrate'yi yeniden oluşturun. Ayrıca substrat ışığa duyarlı olduğu gibi karanlıkta veya düşük ışık koşullarında bu adımı gerçekleştirin.
Sonra 20S tsay tampon kullanarak yeni bir 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp proteozom substrat bir ila 20 seyreltme oluşturun. 96 kuyu plakasına istenilen numunelerin normalleştirilmiş miktarını ekleyin. Her örneği yinelenen olarak çalıştırın.
İhtiyaç duyulan numune miktarı doku hazırlığına göre değişir. Genellikle, 10-20 mikrogram herhangi bir hücre altı fraksiyonu için yeterlidir. Numune nin iyi hacmini ultra saf suyla 80 mikrolitreye getirin.
Eklenen miktar, eklenen numunenin hacmine bağlıdır. İki ayrı kuyuda, sadece 80 mikrolitre su ekleyin. Bunlar tsay boşlukları olacak.
Her iyi de istinat boşlukları da dahil olmak üzere 20S tsay arabellek 10 mikrolitre ekleyin. Kuyular arasında tutarlı bir hesap hacmi sağlamak için tekrarlayıcı veya otomatik pipet kullanın. Işıkları kapatın veya karanlık bir odaya girin.
Seyreltilmiş AMC standartlarının 100 mikrolitresini her standart için tek bir kuyu kullanarak yeni bir kuyuya ekleyin. Karanlıkta, numune ve test boşlukları içeren kuyulara 10 mikrolitre seyreltilmiş proteozom substrat eklemek için tekrarlayıcı veya otomatik pipet kullanın, ancak AMC standardı na uygun değildir. Plakayı plaka okuyucuya yerleştirin ve kinetik çalıştırmaya başlayın.
Kemirgen beyin dokusundan toplanan farklı hücre altı fraksiyonlarda farklı poliubiquitin etiketlerinin sayısallaştırılmasını benzersiz bağlantıya özgü poliubiquitin antikorları ile birlikte çeşitli standart Batı lekeleme protokolleri kullanarak gerçekleştirin. Bazı ubiquitin Batı leke görüntüleri farklı bantları sütunlar sağlarken diğerleri az veya hiç net çizgileri ile karalama benzeri desen üretir. Görüntülenmiş ubiquitin Batı lekeleri nicelik lendirmek için, tüm moleküler standartlar merdiveni uzanan sütun etrafında bir kutu çizin.
Ubiquitin boyama tüm merdiven boyunca uzanır varsa kutuyu ayarlayın. Bu lizin için yaygındır 48 değişiklikler ve hücre altı bölmeleri arasında yaygın olarak değişir. Son olarak, her taraftaki sütunu çevreleyen arka planın ortalama optik yoğunluğu olarak hesaplanan arka planı çıkarın.
Burada gösterilen farklı fraksiyonlarda proteozom aktivitenin nicelaynı hayvanın lateral amigdala toplanan. In vitro proteozoaktivite teşbiti sırasında, sinaptik fraksiyon, sitoplazmik fraksiyonve nükleer fraksiyonda sinaptik fraksiyonda sinadersin başından sonuna kadar artmış saptanan göreceli floresan üniteler. Proteozom inhibitörü beta-lak rus'ların seans boyunca değişmesini engelledi.
Aynı hayvanın lateral amigdalasında proteozom aktivitesinde subsellüler farklılıklar gözlendi. Sinaptik fraksiyoniçinde aktivitede azalmaya karşılık gelen kontrollere göre eğitimli hayvanlarda nükleer proteozom aktivitesinde artış saptırıldı. Sitoplazmik proteozom aktivitesi başlangıç seviyesinde kaldı.
Burada gösterilen öğrenme sonrasında aynı hayvanın lateral amigdala bağlantı ya da spesifik protein ubiquitination subsellüler farklılıklar vardır. Sitoplazmik fraksiyondaki azalma ile ilişkili öğrenme sonrasında nükleer fraksiyonda genel olarak her yerde artış oldu. Öğrenmeden sonra, lineer ubiquitination nükleer fraksiyonu arttı ama sitoplazmik veya sinaptik fraksiyonları değil.
İlginçtir, K63 ubiquitination sinaptik fraksiyonu bir azalma ile ilişkili öğrenme sonrasında nükleer fraksiyonu arttı. K48 uniquitination öğrenme den sonra nükleer ve sitoplazmik fraksiyonları arttı ama sinaptik fraksiyonu değil. Bu protokol aynı hayvanın içindeki diğer proteinlerin hücre altı dağılımını ve işlevini anlamak için de kullanılabilir.
