Bu gerçek zamanlı RT-PCR hızlı bir şekilde ante-mortem ve post-mortem örnekleri kuduz tanısı için uygundur. Pan-Lyssavirus astarları Lyssavirus cinsinin tüm üyelerini tanımlamak için optimize edilmiştir. Bu, klinik örneklerden son derece farklı türler de dahil olmak üzere Lyssavirus cinsi genelinde virüsleri algılayan hızlı, hassas ve kapalı tüp testidir.
OIE son zamanlarda kuduz enfeksiyonu rapor moleküler tahliller kabul etti. Bu durum, virüs kültürü veya antijen algılama yöntemleri yle her zaman tanı konulamayacak çürümüş örnekler için özellikle önemlidir. Bu testin hassasiyeti nedeniyle, kontaminasyon riskini en aza indirmek için farklı aşamaların ayrılması da dahil olmak üzere iyi bir laboratuvar uygulaması hayati önem taşımaktadır.
Prosedürü gösteren Daisy Jennings, benim laboratuvarımdan bir teşhis uzmanı olacak. RNA'yı mikro hacim spektrofotometreile ölçerek başlayın. Makinenin RNA olarak ayarlandığından emin olun ve makineyi normalleştirmek ve bir taban çizgisi oluşturmak için 1-2 mikrolitre moleküler sınıf su kullanın.
RNA konsantrasyonu ölçün ve mikrolitre başına bir mikrograma ayarlayın. PCR plakanızın düzenini hem test hem de kontrol örneklerini dikkate alarak bir elektronik tabloyla planlayın. Yüzeyleri dezenfekte ederek bir PCR iş istasyonu hazırlayın ve UV kabini kullanıyorsanız, başlamadan 10 dakika önce UV ışığını açın.
Çözülmek için reaktifleri ve astarları dondurucudan çıkarın ama enzim karışımını her zaman buzda tutun. Sıvı toplamak için reaktifler ve santrifüj kısaca karıştırın. El yazması talimatlara göre Lyssavirus ve Beta-Actin için PCR ana karışımları hazırlayın.
Kullanıma hazır olana kadar ana karışımları buzüzerinde bırakın. Hazırlanan ana makineyi karıştırın ve santrifüj edin ve 19 mikrolitreyi PCR makine uyumlu plaka veya tüp şeridinin ilgili kuyularına dağıtın. Ayrı bir odada veya UV kabininde, dikkatlice hazırlanan RNA bir mikrolitre ekleyin.
UV kabini kullanıyorsanız, başlamadan 10 dakika önce UV ışığını açın. Test örneklerini sonra pozitif denetim ve hiçbir şablon denetimi ekleyin. Ana karışımlara RNA eklerken, doğru kuyuya eklendiğinden emin olun.
Bu adıma yardımcı olmak için bir plaka planı kullanın. Plakayı kapakların plaka boyunca düz olup olmadığını kontrol edin ve kuyuların altındaki tüm sıvıyı toplamak için aşağı doğru döndürün. Her kuyunun aynı sıvı hacmine sahip olduğundan ve kabarcıkların görünmediğinden emin olun.
Daha sonra örnekleri PCR makinesine aktarın. SYBR Green'i seçerek programı dissociation ile açın. Örnek türü olarak bilinmeyen seçerek analiz edilecek kuyuları ve floresan boya olarak SYBR'yi seçin.
Plaka düzenindeki kuyuları, testin Lyssavirus L veya Beta-Actin için olup olmadığını içeren örnek bilgilerle etiketlendirin. Termo profil kurulumu na tıklayın ve el yazmasında belirtildiği gibi termal bisiklet koşullarını değiştirin. Başlat'ı tıklatın ve dosyayı kaydetmek için bir konum seçin ve çalışma sonunda lambayı kapatmak için kutuyu işaretleyin.
Lamba ısınmadan önce başlama seçeneği göründüğünde, şimdi çalıştır'ı tıklatın, ancak lambanın ısınmak için 15 dakikadan az olması gerektiğini sağlayın. PCR çalışması tamamlandığında, veri çözümlemesi ile devam edin. İlk olarak, Lyssavirus amplifikasyon çizimlerini analiz edin.
Pozitif numuneler üstel rampalar gösterirken, negatif örneklerde CT değeri olmayan düz amplifikasyon çizimleri vardır. Daha sonra, kontrol örneklerinin yanı sıra test örneklerinin Lyssavirus ayrışma eğrisi sonuçlarını analiz edin. Lyssavirus pozitif numunesi 77 ile 80 santigrat derece arasında erime sıcaklığına sahip olacak ve pozitif kontrolle çakışacak.
Daha sonra, genel sonucu yorumlamak için kontrollerle karşılaştıran Beta-Actin amplifikasyon çizimlerini ve dissociasyon eğrilerini analiz edin. Metin raporunu görüntüleyin ve denetim RNA'sı için elde edilen CT ve TM değerlerini bir kontrol kartına kaydetmek için çalışmanın başarılı olduğunu ve test örnek sonuçlarının raporlanabileceğini doğrulamak için ayrıntıları kullanın. Bu protokol, pan-Lyssavirus RT-PCR'nin rna seyreltme serisi bir kontrol standardı virüs üzerindeki hassasiyetini göstermek için kullanılır.
Amplifikasyon eğrisi, 10 pikogram kadar az Lyssavirus tespit edilebileni ve ayrışma eğrilerinin ürünün erime sıcaklığını doğruladığını gösterir. Erime sıcaklığı amplicon Lyssavirus özgü olduğunu doğrulamak için kullanılır. Buradaki sonuçlar, Lyssavirus cinsi 77.34 ile 79.67 santigrat derece arasında erime sıcaklık aralığı olduğunu gösteriyor.
76.8'in altındaki erime sıcaklık değerleri ve 80.2'nin üzerindeki erime sıcaklıkları spesifik olmayan olarak kabul edilir. Bu RT-PCR testinin duyarlılığı da üç Lyssavirus pozitif beyin örneğinden RNA saptanarak belirlenir. Üç örnekten ikisi için hedef RNA'nın mikrolitrebaşına 0.1 pikogram kadar az tespit edilebilir.
Özellikle, tüm tanınan Lyssavirus türlerinin temsilcileri bu testi kullanarak tespit edilir. Tükürük veya BOS gibi klinik örneklerden RNA ekstrelerinin analiz edilmesi durumunda, beta-aktin sonuçları konak nükleik asit eksikliği nedeniyle negatif olabilir. Eksojen bir denetimin eklenmesi bu sorunu çözebilir.
Lyssavirus pozitif örneklerin dizilimi, kuduz enfeksiyonunun coğrafi ve konak kökenleri hakkında ek bilgi sağlamak için tavsiye edilir. Lyssavirus pozitif veya şüpheli pozitif örneklerin işlenmesi yerel sağlık ve güvenlik yönergelerine uygun olmalıdır. Çıkarılan RNA bulaşıcı değildir, bu nedenle düşük çevreleme laboratuvarları içinde işlenebilir.
