Çeşitli sığır beyin yapılarında kuduz virüsünün niceliği. Meksika önemli hayvancılık potansiyeline sahip bir ülkedir. Hayvancılık üretiminin en yüksek olduğu eyaletler, kuduzun ana vericisi olan vampir yarasa Desmodus rotundus'un varlığı nedeniyle kuduz salgınları için risk altında olan hem nemli tropikal bölgeleri hem de kuru bölgeleri içerir.
Kuduz virüsünün saptanması nükleoprotein N geni öncelikle moleküler testlerle kuduz tanısı için kullanılır. PCR tabanlı yaklaşımlar kullanılarak, dna nükleotid dizisinin seçici ve tekrarlayan amplifikasyonu yoluyla klinik bir örnekte minimum miktarda enfeksiyöz ajan tespit edilebilir. qRT-PCR, floresan sinyal artışlarının tek bir reaksiyondaki PCR ürün miktarıyla doğru orantılı olduğu bir molekülün tespitine ve nicemine dayanır.
Nükleik asit hedefinin kopyalarının sayısı arttıkça floresan da artar. Buna dayanarak, çalışmanın amacı, kuduz enfeksiyonuna bağlı olarak, ölümden sonra sığır beyinlerinin farklı anatomik yapılarındaki viral parçacıkların sayısını belirlemek için nicel qRT-PCR kullanmaktı. Toplam RNA, aşağıdaki protokole göre organik bir ekstraksiyon yöntemi kullanılarak doğrudan sığır beyinlerinden çıkarılmıştır.
Guanidinium izotiyosiyanat içeren ticari olarak mevcut bir reaktif kullanarak toplam RNA'yı çıkarmak için her anatomik yapıdan 100 miligram beyin dokusu kullanın. Mikrotüp içinde küçük bir pestil bulunan bir Dounce homojenizatını maksimum hızda 15 saniye boyunca kullanarak girdaplayarak guanidinyum izotiyosiyanat reaktifinin bir mililitresinde her yapıdan toplam 100 miligram dokuyu manuel olarak homojenize edin. Numuneleri beş dakika boyunca buzun üzerinde kuluçkaya yatırın ve ardından 200 mikrolitre kloroform ekleyin.
Numuneleri 15 saniye boyunca kuvvetlice karıştırın. buz üzerinde iki ila üç dakika kuluçkaya yatırın ve sonra 12.000 x g'da 15 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin. Sulu fazı temiz bir tüpe aktarın ve 500 mikrolitre izopropil alkol ekleyin.
Numuneleri 21 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatır. Numuneleri 12.000 x g'da 10 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin. Sulu süpernatantı pipetleme ile epire edin.
İzole RNA tüpte bir pelet olarak mevcut olacaktır. Daha sonra, RNA peletini% 75 etanol bir mililitre ile pipetleme ve santrifüj ile 7, 500 x g dört santigrat derecede beş dakika boyunca yıkayın. Süpernatantı kurutun ve RNA peletini oda sıcaklığında 21 derece kurutun.
Daha sonra, peletı 50 mikrolitre çekirdeksiz suda seyreltin. Spektrofotometre kullanarak 260 nanometrede RNA konsantrasyonunu ve kalitesini belirleyin. In vitro transkripsiyon bir hedef genin mRNA'ını oluşturur.
Tam RABV N genini yükselten bir astar çifti ve qRT-PCR tahlili için pozitif kontrol olarak kullanılan bir astar çifti kullanın. Bu astarlar, tam RABV N genini güçlendirmek ve T7 polimerazını tanıyan bir promotör eklemek için tasarlanmıştır. Tüm N geni RABV'yi güçlendirmek için trans ve RAB primerlerini ileri ve geri ve yüksek doğrulukta bir PCR kiti kullanın.
Her reaksiyon için, her astarın 10 mikromolar ve 0,5 birim yüksek kaliteli polimeraz ile temiz bir PCR tüp reaksiyon tamponu ekleyerek bir PCR ana karışımı hazırlayın. PCR ürününü in vitro sentez için bir şablon olarak kullanmak ve enzimatik reaksiyonun bileşenlerini çıkarmak için, üreticinin talimatlarına göre, PCR ürününü sütun bazlı bir yoğunlaştırıcı kiti kullanarak arındırın. Ve sonra spektrofotometre kullanarak ölçün.
RNA sentezi için, aşağıdaki reaksiyon karışımına sahip bir in vitro transkripsiyon kiti kullanın:beş mikrolitre T7 transkripsiyon 5X tampon, her trifosfat nükleotitten 1,9 mikrolitre, 10 mikrogram saflaştırılmış RABV N DNA ve enzim karışımının 2,5 mikrolitresi. Daha sonra, karışımı dört saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ardından, reaksiyon karışımına mikrogram Rnase Içermeyen DNaz başına bir üniteden bir mikroliter ekleyin ve DNA kirlenmesini ortadan kaldırmak için 37 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın.
Tüp bebek transkriptif RNA'sını arındırın ve ardından fenol:kloroform:izoamil alkol kullanarak 25:24:1 oranında konsantre edin. Saflaştırılmış RNA peletini 70 mikrolitre TE arabelleğine yeniden depolayın ve kullanıma kadar 80 santigrat derecede saklayın. Yaklaşık beş mikrogram PCR ürünü elde edilene kadar PCR protokolünü tekrarlayın.
Saflaştırma ve konsantrasyondan sonra, in vitro transkript N gen mRNA mikroliter başına 4.711 mikrogram konsantrasyonda mevcut olacaktır. In vitro transkriptörlü mRNA'nın bu protokolün beşinci adımını takiben N genine karşılık geldiğini onaylayın ve bunu gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu için pozitif bir kontrol olarak kullanın, qRT-PCR. Gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu için, pozitif kontrol olarak tam N genini kodlarken bir in vitro mRNA transkript kullanın.
Ticari bir tek adımlı qRT-PCR kiti ile birlikte, üreticinin talimatlarına göre hibridizasyon probları kullanmak. Aşağıdaki termal bisiklet koşullarını kullanarak RABV'nin korunmuş bir bölgesini tespit etmek için Coronado ve iş arkadaşı 2010 tarafından açıklanan astarlarda probu kullanın. Altı ayrık seyreltme elde edilene kadar mRNA'nın mikroliteri başına bir mikrogramı tüplere seri olarak pipetleme yaparak in vitro dilimlenmiş mRNA'nın seri seyreltmelerini gerçekleştirin.
Tüpleri standart eğriyi oluştururken kullanılmak üzere üç taraflı olarak 100 mikroliter hacimde hazırlayın. Daha önce açıklandığı gibi qRT-PCR gerçekleştirin. Standart bir eğri oluşturmak için çalışan reaksiyonlarla eş zamanlı olarak çeşitli beyin örneklerini işleyerek ve hücre kültüründen izole edilmiş pozitif kontroller, negatif kontroller ve süpernatantlar kullanarak bir rotorlu termal çevrimde qRT-PCR gerçekleştirin.
Testin algılama, test etkinliği ve duyarlılığı sınırını değerlendirmek için, aynı koşullar altında üç taraflı olarak standart bir eğri kullanın. RABV gen N'nin tespiti için, daha önce açıklanan PCR kitini kullanarak qRT-PCR gerçekleştirmek için alan örneklerinden, pozitif kontrollerden, negatif kontrollerden ve hücre kültürü süpernatantlarından RNA'yı kullanın. Sığır beyin örneklerinde bulunan RABV genomunun kopya sayısını belirlemek için, standart eğriden ve biyolojik örneklerden ve kalibrasyon eğrisi denkleminden enterpolasyonlu olanlardan CT verileri elde etmek Bu şekil, sığır beyin dokularının doğrudan immünofluoresansa göre pozitif lekelenme gösterdiğini göstermektedir.
Sonuçlar korteks, talamus, medulla, pons ve boynuzda sırasıyla RABV için %100%100%83.3%66 ve %50 pozitiflik göstermektedir. Bu sonuçlar önceki sonuçları doğrular ve her beyinden incelenen yapılardan en az üçü RABV için pozitifti. Öte yandan, standart eğrinin denklemi, örnekteki RABV genetik içeriği miktarı ile PCR güçlendirilmiş parçanın boyutu arasındaki ilişkiyi gösterir.
Nanogramlardaki RABV genetik içerik miktarı, bu şekilde sunulan denklem kullanılarak kalibrasyon eğrisinde BT değerlerinin enterpolasyonu ile ortaya çıkarılmıştır. Bu denklem kullanılarak, viral RNA'nın mikroliteri başına bir kez 10 ila beşinci mikrogram algılama sınırının RABV genomunun 36 kopyasına karşılık geldiği bulunmuştur. Bu sonuçlar, tahlilin hassas olduğunu ve düşük sayıda RABV N geni içeren örneklerde virüsü tespit etmek için kullanılabileceğini göstermektedir.
Tahlilin verimliliği, 3.28 olan standart eğrinin eğimi kullanılarak hesaplandı. qRT-PCR için kullanılan örneklerde RABV N geninin amplifikasyonu saptandı. Mevcut viral kopya sayısını belirlemek için, her numunenin CT değerleri kalibrasyon eğrisi denklemi kullanılarak enterpolasyona alındı.
Nanogramlarda elde edilen sonuçlar burada açıklanan formüle ikame edildi. Bu tabloda qRT-PCR ve DFA arasındaki karşılaştırmalı sonuçlar göster gösterdir. qRT-PCR tahlillerinin sonuçları DFA kullanılarak elde edilenlerle tutarlıydı.
C ve D olgularında qRT-PCR testinde elde edilen sonuçlara göre talamus, RABV N geninin en yüksek sayıda kopyasına sahip yapıdır. Bu, hipotalamik ve talamik nöronların erken enfeksiyonunun, bu nöronların bir hayvanın vejetatif işlevlerini kontrol ettiği göz önüne alındığında, hastalığın gelişiminde önemli olduğunu göstermektedir. Her numunenin her yapısında tespit edilen RABV N geninin kopya numaraları şunlardır: qRT-PCR testinin hassasiyeti ve özgüllüğü tüm örnekler pozitif olduğu için ikimiz de%100'dür.
Bu sonuç, örneklerin ilk teşhisleriyle tutarlıdır. qRT-PCR oldukça hassas bir tekniktir. Bazı adımlar en iyi sonuçları elde etmek için kritik öneme sahiptir.
Bunlardan biri, RNA ekstraksiyonu için numunelerin uygun şekilde işlenmesidir. RNA kolayca bozuldu ve sonuçlar bu nedenle etkilenebileceği için bu adım çok önemlidir. Numuneyi soğuk koşullarda, işlem sırasında yaklaşık dört derecelik bir derecede korumayı düşünün.
Ek olarak, in vitro transkripsiyonda belirtildiği gibi birkaç tur PCR uygulamasının gerçekleştirildiğini düşünün. Bu çalışmada yapılan qRT-PCR tahlili, rabv N geninin miligram doku başına 36,3 kadar kopyasını tespit edebilir. qRT-PCR için en uygun beyin yapıları korteks ve talamusu içeriyordu.
Bu, bu yapılarda RABV N geninin daha yüksek konsantrasyonlarının tespit edildiği ve RABV referans testi kullanılarak da pozitif olduklarının tespit edildiği gözlemlerine dayanmaktadır. Test, çeşitli örneklerde virüsün dokuzuncu kopyalarına kadar 0.00023 çarpı 0.00023 çok düşük konsantrasyonları tespit edebildi. Örnekteki viral parçacıkları ölçmenin yanı sıra, test burada sunulan RABV'nin tespiti için iyi bir alternatif tanı ve araştırma aracı sağladığı görülmektedir.
