Bu protokol, küçük tahıl ürünlerinde EMS mutagenezi ile yüksek mutasyon sıklığına sahip sağlam TILLING popülasyonlarının gelişimini ayrıntılarıyla anlatır. TILLING popülasyonları fonksiyonel genomik lerin yanı sıra küçük tahıl ürünlerinde ileri genetik uzay geni keşfi için de kullanılabilir. Bu teknik kullanılarak geliştirilen TILLING popülasyonları yüksek mutasyon frekanslarına sahiptir ve bu protokol herhangi bir genotipiçin uygulanabilir.
Cel-1 test bazlı mutasyon tespiti temel laboratuvar ekipmanları kullanılarak yapılabilir. En önemli adım optimal EMS konsantrasyonu belirlemektir. Bu nedenle, bir EMS doz eğrisi bireysel nüfus için özel olarak yapılmalıdır.
Başlamak için, her altı 250 mililitre cam şişeleri ilgi genotip ile 100 tohum ıslatın, distile su 50 mililitre içeren. Imbibition için oda sıcaklığında sekiz saat boyunca 100 RPM çalkalayın. Daha sonra, bir duman kaputunda, EMS sıvı ve distile su karıştırarak beş farklı konsantrasyonlarda EMS çözeltileri 50 mililitre hazırlamak.
Imbibition sonra, beş şişesu dışarı decant. Imbibed tohumiçeren beş şişenin her birine 50 mililitre EMS çözeltisi ekleyin. 75 RPM ve oda sıcaklığında 16 saat boyunca şişeleri sallayın.
Şimdi, EMS çözeltisini boş bir atık şişesine boşaltın ve her işlem için ayrı ayrı toplamak için boş bir atık şişesine yerleştirilen işlenmiş tohumları peynir bezine dökün. Tohumların dökülmesine yardımcı olmak için ekstra su kullanın. Ayrıca, kirlenmiş şişelerin duvarına eMS inaktive çözeltibirkaç mililitre sprey.
Kullanılmış pipet uçlarını 24 saat boyunca çözeltiye batırın. 24 saat boyunca tedavi etmek için bir hacim EMS inactivating çözeltisi ekleyerek kullanılan EMS çözeltisini devre dışı. Bir büküm kravat kullanarak, cheesecloth içinde EMS tedavi tohumları tutun ve iki saat boyunca çalışan musluk suyu altında yıkayın.
Yıkadıktan sonra, her tohumu ayrı ayrı çömlekçilik toprağı içeren kök eğitmenlere nakledin. 16 saatlik bir ışık süresi için 20 ila 25 santigrat derecede bitki büyütün. 15 günlük ekimden sonra bitkileri kontrol edin ve çimlenmeyi başaramayan tohum sayısını sayın.
Bitki hayatta kalma verilerini kaydedin. Eğer sağkalım oranı %40-60 arasında değilse, istenilen öldürücülük oranına ulaşana kadar modifiye konsantrasyonile ikinci bir doz optimizasyonu turu yapın ve mutagenez deneyinden sonra M2 bitkilerinin yaprak dokusunu 96 kuyudoku toplama kutusunda toplayın. Doku, kendine özgü M1 bitkilerinden yetiştirilen M2 bitkilerinden toplanır.
Her M1 tesisinden bir M2 tesisi gösterilmektedir. Üreticinin tavsiyelerini izleyerek DNA arıtma sistemi ile bir bitki DNA çıkarma kiti kullanarak DNA ayıklayın. Daha sonra, 16 yuva ile LV plakaları içine DNA ekstresi iki mikrolitre yükleyin.
260 ve 280 nanometre dalga boylarında bir spektrofotometre kullanarak DNA'yı ölçün. DNA konsantrasyonu mikrolitre başına 25 nanogram çekirdeksiz su ile seyreltin. Her numunenin satır ve sütun kimliğini korurken, dört 96 kuyu bloğundaki her kuyudaki DNA'yı bir havuz plakasına birleştirerek 200 mikrolitreden oluşan dört kez DNA havuzu oluşturun.
Daha sonra, her tüp PCR tampon, ileri ve ters astarlar ve DNA polimeraz el yazmasına göre ekleyerek gen özel astarlar için bir PCR ana karışım tüp hazırlayın. Aliquot bir 96 iyi PCR plaka kuyuları içine ana karışımı. Ardından, havuza girilen DNA şablonu ekleyin.
PCR tüplerini bir termal döngüce yükleyin ve TERMAL döngücün üzerindeki PCR reaksiyonu çalıştırmak için bir touchdown profili kullanın. Uyumsuz NA'lar arasında heterodupleksoluşturmak için, PCR ürünlerini farklı bir programda termal döngüye kuluçkaya yatırın. Daha sonra, heteroduplexed PCR ürünlerinin her birine ev yapımı Cel-1 ensoneklease 2,5 mikrolitre ekleyin.
45 santigrat derecede 45 dakika kuluçkaya yat. Bundan sonra, pH sekiz 0,5 molar EDTA 2.5 mikrolitre ekleyerek Cel-1 reaksiyonu sona erdirmek. Yük 30.5 her Cel-1 işlenmiş ürün boya beş mikrolitre ile karışık 3% agarose jel üzerine ve iki buçuk saat boyunca 100 volt çalıştırın.
Mutant havuzları deconvolute için, ilk reaksiyon M2 DNA 2.5 mikrolitre ve yabani tip DNA 2.5 mikrolitre ve ikinci reaksiyon m2 DNA sadece beş mikrolitre içeren bireysel M2 DNA için iki PCR reaksiyonları çalıştırarak mutantların zigositlik belirlemek. Bu protokol, EMS'nin küçük tahıl ürünlerinin mutagenize ve mutant karakterizasyonu gösterir. Doz eğrisi buğday üç farklı tür için istenen% 50 sağkalım oranları için optimal EMS dozları gösterir.
M2 popülasyonunda kolayca tanımlanabilir fenotiplerin varlığı küçük tane popülasyonlarında mutagenezin etkinliğini doğrular. Burada M2 TILLING popülasyonlarında mutant fenomenlerin dört örneği, arpa M2 popülasyonundaki bir albino mutant, arpa M2 popülasyonunda klormutantı, Aegilops tauschii M2 popülasyonunda pembe renk değişikliği olan bir değişkenli mutant ve Triticum monococcum M2 popülasyonunda düşük çapalayan bir mutant verilebilir. Agarose jel platformlarında Cel-1 kullanılarak yapılan bir mutant tanımlama, 12 mutant havuzundan benzersiz yarık bantlarla tanımlanan potansiyel bir mutant havuzu gösteriyor.
Mutant havuzlarının dekonvolution mutasyon un zigosititliliğini belirledi ve mutasyonun tek tek örneklere kadar izini sürmeye yardımcı oldu. A4 havuzunda Box 4 ve Box 4 yabani tip DNA örneklerinde cleaved bantlarla endike heterozigot mutasyonlar vardı. H5 havuzunda homozigot mutasyonlar vardı çünkü sadece Box 5 H5 yabani tip DNA örneğinde benzersiz bölünmüş bantlar mevcuttu.
En önemli adım% 40-60 öldürücülük oranı elde etmek için EMS optimal konsantrasyonu belirlemektir. Mutasyon sıklığı yüksek bir TILLING popülasyonu geliştirildikten sonra herhangi bir genin fonksiyonel karakterizasyonu için kullanılabilir. Ayrıca, nüfus ürün geliştirme için yararlı genetik varyasyon kaynağı olabilir.
TILLING, model ve ekin bitkilerinde fonksiyonel genomik çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Elde edilen mutasyonların aralığı yanlış, nakavt, sessiz, hatta yanlış formları olabilir. EMS bir mutajendir.
Bu nedenle, EMS'yi kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. Artık çözeltileri ve kullanılan pipet uçlarını dezenfekte edin.
