Tüm meslektaşlarımızın katkıları ve ortak çalışanlar, sonuçlar için bu el yazması (görsel amacıyla) sevk edilmiştir orijinal çalışmalarımız için kabul etmek istiyoruz. Yazarların iş hibe Ulusal Enstitüsü diş ve ulusal sağlık Enstitüleri (1R01DE026043) AB için kraniyofasiyal araştırma ve California Tobacco-Related hastalığı araştırma programı için AB (Üniversitesi tarafından desteklenmektedir TRDRP-26IR-0015) ve ST (TRDRP-25IP-0001). Sponsorlar çalışmanın çalışma tasarım, veri toplama, veri analizi, veri yorumu, rapor yazma veya yayın için göndermek için karar herhangi bir rolü yoktu.

1. fare embriyonik fibroblastlar genomik DNA izolasyonu
Not: Birincil fare embriyonik fibroblastlar göre yayımlanmış protokolü53C57BL/6 genetik arka plan ile BB transgenik fareler türetilen embriyo etkilenmezsiniz. Bu iletişim kuralı için başlangıç materyali 1 x 106 -bileşik karşı test denetimi ile tedavi 1 x 107 embriyonik fibroblast hücreleri oluşur. Hasat ve standart yöntemlerle bu hücrelerin sayma başvurular10,54,55açıklanmıştır.
<ol><li>Hazırlamak bir (0,3 M Sükroz, 60 mM KCl, 15 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0,5 mM spermidine, 0.15 mM spermine ve 2 mM EDTA) tampon, tampon B (150 mM NaCl ve 5 mM EDTA, pH 7.8) ve C (20 mM Tris-HCl, pH 8.0 arabellek 20 mM NaCl, 20 mM EDTA ve % 1 SDS) peşin ve en çok bir yıl54,55(RT) oda sıcaklığında koru.</li>
	<li>Geniş bir yelpazede kullanarak yukarı ve aşağı üst üste pipetting tarafından 15 mL konik santrifüj tüpü A 1000 µL pipet ucu delik 2-4 mL arabellek hücrelerde resuspend.</li>
	<li>Bir birim (2-4 mL) arabellek A içeren %1 octylphenoxypolyethoxyethanol (örneğin, Nonidet P40) ekleyin cam serolojik pipet kullanarak.</li>
	<li>Buz 5 min için tüp kuluçkaya.</li>
	<li>1000 x g RT., 5 min için de tüp santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Süpernatant atın ve Pelet 10-15 mL arabellek kullanarak bir cam serolojik pipet ile yıkayın.</li>
	<li>Pelet 2-4 mL arabellekte B. resuspend</li>
	<li>Bir birim (2-4 mL) arabellek C içeren 600 µg/mL İndinavir K. Ekle</li>
	<li>Tüp 37 ° C'de 3 h için kuluçkaya</li>
	<li>RNase A 100 µg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin.</li>
	<li>Tüp bir ek 1 h 37 ° C'de için kuluçkaya</li>
	<li>Bir birim (2-4 mL) fenol ekleyin (0.1 doymuş M Tris-HCl, pH 8.0):chloroform:isoamyl alkol (25:24:1 vol/vol). Not: Fenol ağır sağlık tehlike oluşturabilir ve olağanüstü dikkatle ele alınması gerekir. Fenol cilt için son derece korozif ve içinden kolayca emilir ve diğer efektler sergiler. Fenol, işleme her zaman kullandığınızda double gloving, koruyucu gözlük giymek ve kimyasal duman mahallede iş.</li>
	<li>İyi bir tüp rotator 4 ° C'de 5 min için tüp ters çevirme tarafından mix</li>
	<li>1000 x g 4 ° C'de 5 min için de tüp santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Sulu faz (üst katman) için yeni bir tüp cam serolojik pipet kullanarak kaldırın.</li>
	<li>Fenol: kloroform: izoamil alkol ayıklama 1-3 kat sulu faz açıktır ve arabirimidir artık bulanık kadar yineleyin.</li>
	<li>1/10 birim (200-400 µL) 3 M sodyum asetat, pH 5.2 ekleyin.</li>
	<li>2.5 hacmi (5-10 mL) % 100 etanol (soğuk) ekleyin ve 2-3 dakika için elle tüpü yavaşça tersine çevirin.</li>
	<li>Bir cam kanca ile DNA biriktirmek ve %70 1 – 5 mL içeren yeni bir tüp transferi etanol ve iyice yıkayın. Alternatif olarak, DNA cips ve %70 1 – 5 mL ile iyice yıkayın için 4 ° C yüksek hızda (3.500 x g) tüp santrifüj kapasitesi etanol.</li>
	<li>Yüksek hızda (3.500 x g) tüp RT santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırmak ve 10-15 dk için DNA kuruması.</li>
	<li>10-100 µL TE arabellek (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) DNA'daki dağıtılması ve 4 ° c (için bir ay kısa depolama) veya (daha uzun süre depolama)-20 ° C'de depolayın. λ Select CII tahlil için DNA'ın konsantrasyonu en uygun olduğunu 0.5-1.0 µg/µL (TE arabellekte)56.</li>
</ol>2. Vitro ambalaj tepki
<ol><li>Bir ambalaj tepki ~ 5 µg genomik DNA ekleyin (son hacim: 8 – 12 µL, genomik DNA Bölüm 1 ' fare embriyonik fibroblastlar tedavi vitro bileşik bir testiyle veya denetiminden izole) ilk içeren bir microcentrifuge Tube reaksiyon mix (~ 10 µL). Not: İçinde-ev hazır veya piyasada bulunan λ ambalaj özleri farklı laboratuvarlarda kullanılır. Ticari ambalaj özü kiti burada56 kullanılan (bkz. Tablo reçetesi) kırmızı tüpler ilk tepki mix (~ 10 µL) ve mavi tüpler bulunan ikinci reaksiyon mix (en az 5 tepkiler ~ 70 µL).</li>
	<li>30 ° C'de 90 dk için tüp kuluçkaya</li>
	<li>Gerekli birim (~ 12 µL) tüp ikinci reaksiyon karışımı ekleyin.</li>
	<li>Tüp bir ek 90 dk 30 ° C'de için kuluçkaya</li>
	<li>
SM arabellek 1.1 mL tüp ekleyin. Not: Bu çözüm (Yani, ambalaj tepki karışımı) 1 mL λ CIIeleme için kullanılan-mutant. Geri kalan titering için kullanılır.<ol>
<li>SM arabellek 5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4.7H2O, 50 mL karıştırarak hazırlayın 1 M Tris-HCl (pH 7.5) ve 5 mL %2 (w/v) jelatin. DH2O son hacmi 1 litre, otoklav ilâ 1 yıl için oda sıcaklığında 30 dk. mağaza için ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Girdap 10 için paketlenmiş DNA örneği içeren tüp RT (dinç vortexing), s.</li>
	<li>Nabız microcentrifuge ve buz üzerinde mağaza tüpte kullanıma hazır kadar spin. Örnek ambalaj aynı gün içerisinde kullanılacak gitmiyor, kloroform mL paketlenmiş DNA'ın başına 50 µL ekleyerek her örnek, girdap yavaşça ve 2 hafta için 4 ° C'de depolayın.</li>
</ol>3. E. coli G1250 bakteriyel kültür hazırlama
<ol><li>
En az iki gün önce kaplama, Escherichia coli (e.coli) G1250 TB1-sefaloridin agar Tabaklarda gelen birkaç bakteriyel çizgi plakaları olun.
	<ol>
<li>TB1-sefaloridin Ağar kaplamalar aşağıdaki gibi hazırlayın. 5.0 g NaCl, 10,0 g kazein pepton ve 12,0 g agar karıştırın. 800 mL dH2O. eklemek 1 mL %0.1 tiamin hidroklorür ekleyin. PH 7.0 NaOH veya HCl. Ekle ile ayarlamak dH2O son hacmiyle 1 litre.</li>
		<li>Mix iyi ve otoklav 30 dk. 55 ° C'ye soğutmak için izin ver 50.0 mg sefaloridin ekleyip karıştırın. Steril 100-mm petri yemekler (çanak başına 20-25 mL) içine dökün. Tabaklar 4 ° c ilâ iki hafta için saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bakteriyel çizgi plakaları bir sabit 30 ° C kuluçka için en az 24 saat kuluçkaya.</li>
	<li>
Bir gün önce kaplama, TB1 sıvı orta 10 mL % 20 (w/v) maltoz-1 M MgSO4 çözüm bir steril 50 mL vidalı kapak konik tüp 100 µL ile birleştirir.
	<ol>
<li>TB1 sıvı orta şekilde hazırlayın. Mix 5.0 g NaCl ve 10.0 g kazein pepton, 800 mL dH2O, 1 mL %0.1 tiamin hidroklorür, ekleyebilir ve 7.0 NaOH veya HCl pH ayarlayabilirsiniz. Mix iyi ve otoklav 30 dakika süreyle RT orta üç aya kadar saklamak, sonra dH2O son hacmi 1 litre için ekleyin.</li>
		<li>%20 (w/v) maltoz-1 M MgSO4 aşağıdaki gibi hazırlayın. Mix 20.0 g maltoz ve 24.6 g MgSO4. 7H2O, o zaman 100 mL nihai bir birime dH2O ekleyin. Filtre sterilize ve 6 aya kadar 4 ° C'de depolayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sömürgeler steril inoculating döngü56kullanarak bakteriyel çizgi plaka ile sıvı orta aşılamak.</li>
	<li>Sıvı kültüründe gecede 30 ° C ile dinç (250 – 300 rpm) sallayarak kuluçka sallayarak kuluçkaya.</li>
	<li>Kaplama günde konik tüp G1250 sıvı kültür 1.500 x g RT bakteri hücreleri cips, 10 min için de içeren santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant atın ve hücre Pelet 10 mL 10 mM MgSO4resuspend.</li>
	<li>1:10 Absorbans ölçmek seyreltme hücre süspansiyon, bir UV-VIS Spektrofotometre (örneğin, 100 µL hücre süspansiyon + 900 µL 10 mM MgSO4)56kullanarak dalga boyu 600 nm.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 0,5 ile 10 mM MgSO4son OD600 oranında seyreltin. G1250 E. coli OD600 ile hazırlanan süspansiyon = 0,5 'G1250 kaplama Kültür' adlandırılır.</li>
	<li>G1250 kaplama kültür buza kapaklarý takýlý içinde 1-2 h.</li>
</ol>4. kaplama paketlenmiş DNA örnekleri
<ol><li>
Bir paket DNA örneği on altı steril 14 x 100 mm2 yuvarlak alt tüpler ve on altı TB1 Ağar kaplamalar hazırlayın. 10'dan her küme için tarama ve altı titering (titresi 20 3) ve üç titresi 100 için kullanılacaktır.
	<ol>
<li>TB1 Ağar kaplamalar aşağıdaki gibi hazırlayın. Mix 5.0 g NaCl, 10,0 g kazein pepton ve 12,0 g Agar, sonra 800 mL dH2O ve 1 mL %0.1 tiamin hidroklorür ekleyin. 7.0 NaOH veya HCl pH ayarlayabilir ve dH2O 1 L. son bir hacim için ekleyebilirsiniz</li>
		<li>Mix iyi ve otoklav 30 dk. 55 ° C-cool, sonra steril 100 mm Petri yemekler (çanak başına 20-25 mL) içine dökün karışımı sağlar. Plakayı 4 ° c ilâ iki hafta için saklayın. Not: En az 24 kullanılmadan önce s TB1 Ağar kaplamalar hazırlanmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her yuvarlak alt tüpün içine G1250 kaplama kültürünün aliquot 200 µL.</li>
	<li>
Titering için1: 100 seyreltme paketlenmiş DNA örneği yapmak ve de vortexing tarafından (Yani, 10 µL paketlenmiş DNA örneği + 990 µL SM arabellek) karıştırın.</li>
	<li>1: 100 seyreltme 20 µL her üç titresi 20 tüpler için ekleyin.</li>
	<li>1: 100 seyreltme 100 µL her üç titresi 100 borular için ekleyin.</li>
	<li>
Tarama için100 µL Ekle 'su katılmamış ' her on tarama tüplerinin paketlenmiş DNA örneği.</li>
	<li>Tüm titering ve tarama tüpler işlemek (2 x 3 + 10 = 16 tüpler), aşağıdaki gibi: mix de tarafından yaklaşık 10 için vortexing s ve sonra ana bilgisayarın E. coli phages absorbe sağlamak 30 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>
Mikro dalgada erimiş TB1 kontör agar (55 ° C için soğutmalı) her titresi veya tüp, eleme hemen vortexing tarafından (), karışımı yavaşça 2.5 mL ekleyin ve uygun titresi dökme veya TB1 Ağar kaplamalar eleme.
	<ol>
<li>TB1 en iyi agar aşağıdaki gibi hazırlayın. Mix 5.0 g NaCl, 10,0 g kazein pepton ve 7.0 g Agar, sonra 800 mL dH2O. eklemek 1 mL %0.1 tiamin hidroklorür ekleyin, sonra 7.0 NaOH veya HCl pH ayarlama. Son olarak, dH2O son hacmi 1 litre için ekleyin.</li>
		<li>İyi ve otoklav 20-25 dk. mağaza oda sıcaklığında üç aya kadar karıştırın.</li>
		<li>Kullanım önce hazır TB1 en iyi agar bir mikrodalga eritmek, iyice karıştırın ve bir su banyosu içinde 55 ° C için soğumasını bekleyin. Not: Erimiş ve soğutulmuş TB1 üst her titresi veya tarama tüp içeriği eklenir ve karıştırma sonra uygun titresi veya tarama TB1 agar tabak dökülür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>15-30 dakika oda sıcaklığında, yoğunlaşma önlemek için Aralık kapaklı stand plakaları ver.</li>
	<li>Tabakları ters çevir ve sabit 24 ° C kuluçka makinesine on tarama tabak yerleştirin ve 46-48 h (Yani, seçici koşullar) ve sabit 37 ° C kuluçka altı titresi plakaları için kuluçkaya ve 24 saat kuluçkaya / (Yani, bir gecede Seçici olmayan koşullar). Not: kalite güvence ve sonuçları standardizasyonu için bilinen mutant frekans ile wildtype ve mutant CII karışımı içeren ticari olarak kullanılabilir denetim fajının çözümler paketlenmiş DNA örnekleri kaplama ve tüm tahlil56çalışır.</li>
</ol>5. inceleme titresi ve eleme plakaları CII Mutant frekansı belirlemek için
<ol><li>37 ° C'de 24 h/gecede kuluçka sayısı plaklar sayısı her üç titresi 20 tabakalar ve titresi 100 tabak içinde oluşmuş. Plaklar daha kolay tanımlamak için plaka beyaz bir ışık kutusunun yanındaki ve karanlık bir arka plan (bkz. Şekil 2) kaldırıldı kapak ile tutun.</li>
	<li>Plaklar sayısı ortalama (ortalama) sayılan titresi 20 tabak ve titresi 100 tabak her kümede yapmak (her triplicate).</li>
	<li>Ortalama 50-200 plaklar plaka set başına dizi yakın düşüyor titresi plakaları kümesinden seçin.</li>
	<li>Aşağıdaki gibi on tarama levhalar yaylıdır ekranlı plaklar toplam sayısını hesaplar: Toplam ekranlı plaklar (ortalama sayısı plaklar titresi plakaları ÷ seyreltme µL sayısı seçilen titresi plaka kullanılan seçilen küme) = seyreltme faktörü x x µL plaka [100 µL/plaka] eleme başına paketlenmiş DNA örneği sayısı x tabak [10] tarama sayısı. Not: Örneğin, plaklar titresi 20 plakaların kümedeki plaka başına ortalama sayısı 128'dir ve 478 titresi 100 plakaların kümedeki karşılık gelen sayıdır, sayı 128 ekranlı plaklar toplam sayısı hesaplanması için kullanılır , aşağıdaki gibi: (128 ÷ 20) x 100 [µL/plaka] x 10 [plakaları] x 100 [seyreltme faktörü] 640.000 = Bu ortalama titresi 20 plakaları veya titresi 100 Kaplamalar, sayıları sırasıyla temel alıyorsa plaklar ortalama sayısı 5.000 veya 1.000, teksir makinesi için eşdeğerdir.</li>
	<li>24 ° c 46-48 h kuluçka plaklar (Bölüm 5. 1'sağlanan yönergeleri izleyin) on tarama plakaları oluşan toplam sayısını saymak. Not: CII mutant frekans tarama levhalar yaylıdır oluşan plaklar ile ekranlı plaklar toplam sayısı toplam sayısı bölünerek hesaplanır. Yukarıdaki örnekte, sayılan plaklar toplam sayısı on tarama levha kullanarak 112, CII mutant frekans bu DNA örneği için 112 ÷ 640.000 = 17,5 x 10-5olacaktır.</li>
</ol>6. Putative λ CII mutantlar doğrulanması, PCR güçlendirme ve DNA Sekanslama
<ol><li>Steril, geniş-geçişli damlalıklı ucu ile söz konusu plak çekirdek ve bu 500 µL steril SM arabelleği içeren bir steril microcentrifuge tüpüne sınırdışı (yukarı ve aşağı pipetting tarafından).</li>
	<li>Oda sıcaklığında en az 2 h için kuluçkaya veya 4 ° C'de fajının parçacıklar agar elute izin vermek için bir gecede takın.</li>
	<li>Bir steril 14 x 100 mm2 yuvarlak alt tüp G1250 kaplama kültürünün 200 µL özlü fajının çözüm 1 µL ile karıştırın ve RT., 30 dk için kuluçkaya</li>
	<li>2,5 mL 55 ° C erimiş TB1 üst agar kullanarak örnek plaka ve plaka 24 ° c 46-48 h (seçici koşulları), bölümler 4,8-4,10 içinde açıklandığı gibi kuluçkaya.</li>
	<li>İkincil plaklar oluşmuş bir pipet ucu bir tek iyi izole doğrulanmış λ CIIdikkatle almaya kılabilmesi-mutant plak (alt agar dokunmaktan kaçının). Not: sözde CII mutant plaklar Replating iki amaca hizmet eder: (i) eserler kaplama bazen yanlış olabilir küçük boyutlu plaklar için; ve (ii) bir tarama tabaktan alınan bir özel çekirdek mutant olmayan phage(s) ile birlikte bir mutant fajının içerebilir. Düşük yoğunluklu replating üzerinden ikincil plaklar PCR ve sonraki DNA dizi analizi için kirlenmemiş bir mutant şablonu sağlar.</li>
	<li>Plak yukarı ve aşağı pipetting tarafından 25 µL çift distile su içeren bir microcentrifuge tüp aktarın.</li>
	<li>Tüp 5 min için kaynar suda koyun.</li>
	<li>Maksimum hızda (18.000 x g) RT. 3 dakika santrifüj kapasitesi</li>
	<li>10 µL süpernatant, hemen 40 µL PCR mastermix reaktifleri son konsantrasyonları olan 1 x Taq PCR tampon, 10 pmol her ileriye ve geriye doğru astar, her dNTP 12.5 nmol içeren yeni bir microcentrifuge tüp transferi ve 2.5 U Taq DNA polimeraz. Not: İleriye ve geriye doğru astar aşağıdaki gibidir: 5'-CCACACCTATGGTGTATG-3' (-68 -50 CII göre için başlamak kodon pozisyonlar) ve 5'-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3' (+345 365 CII başlama kodonu göre için sırasıyla pozisyonlar).</li>
	<li>Aşağıdaki Bisiklete binme parametrelerini kullanarak şablon yükseltmek: 3 dk denatürasyon 95 ° C'de 30 30 döngüsü tarafından takip s 95 ° c, 1 dk. 60 ° C'de ve uzantısına sahip bir son 72 ° C'de 10 dk 72 ° C'de 1 dk</li>
	<li>CII gen içeren ve piyasada bulunan PCR arıtma kitleri, kullanarak bölge kanat 432 bp PCR ürünü üreticinin yönergelerine göre arındırmak.</li>
	<li>DNA sıralama bir uygun sıralama platformu kullanarak gerçekleştirmek ve mutasyonlar CII transgene algılamak için elde edilen DNA dizilerinin analiz (aşağıdaki nota bakın). Not: Bu en iyi yazılım, web tabanlı T-kahve sıra hizalama server gibi kullanılarak başvuru CII sırası ile hizalama tarafından sağlanır. Program kullanımı hakkında yönergeler için ziyaret edin: <a href="http://tcoffee.crg.cat/">http://tcoffee.crg.cat/</a>
</li>
</ol>

Tüm yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.

λ Select CII tahlil organ/dokulardan BB kemirgenler3türetilmiş hücre genomik DNA kurtarıldı CII transgene mutasyonların tespiti için kullanılır. Bu Transjenik hayvanlar genom CII taşıdığı genetik entegre λLIZ Servisi vektör, birden çok tandem kopyalarını içerir (294 bp) ve lacI (1,080 bp) transgenes, mutational muhabir gen1, 2 , 25. λ Select CI...

Transgenik hayvan modelleri ve mutasyon tespit sistemleri geniş bir memeli hücreleri kanserojen mutagenisitesinin test için geliştirilmiştir. Bunlar transgenik Big Blue (bundan sonra BB adlandırılır) fareler ve λ Select CII mutasyon tespit sistemi mutagenisitesinin deneyler için bu grup ve birçok diğer araştırma grupları dünya çapında1,2tarafından istihdam edilmiştir, 3,4,5,6,7,8,9. Son 16 yıldır, biz bu Transjenik hayvanlar kullanarak çeşitli kimyasal ve/veya fiziksel ajanların mutajenik etkileri araştırdık veya onların karşılık gelen embriyonik fibroblast hücre kültürlerinde bir test karışımı ile tedavi ve daha sonra analiz λ Select CII tahlil ve DNA sıralama, sırasıyla10,11,12,13,14 CII transgene genotip ve fenotip , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. bu Transjenik hayvanlar genom kromozom 4 Çoklu kopya kafa kuyruk concatemer1,2,25üzerinde entegre bir bakteriyofaj λ Servisi vektör (λLIZ) içerir. ΛLIZ Servisi vektör iki mutational muhabir gen taşır yani lacI ve CII transgenes1,2,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45 , 46 , 47. λ Select CII tahlil λLIZ Servisi vektörel çizimler kurtarma organ/dokulardan Transjenik hayvanlar1,2,25 türetilmiş hücre genomik DNA dayanır . Kurtarılan λLIZ Servisi vektörel çizimler sonra bir göstergesi ana Escherichia colibulaşmasını yetenekli λ fajının zihinlerine paketlenmiştir. Daha sonra virüs bulaşan bakteriler puanlama ve CII transgene1,3mutasyon analizi için izin vermek için seçici koşullar altında yetiştirilmektedir.
Burada, biz hücreleri/Transjenik hayvanlar tedavi vitroorganlarının genomik DNA izolasyonu oluşur λ Select CII tahlil için detaylı bir protokol tarif /vivo λLIZ test bileşik, alımı ile olan yakındaki vektörel çizimler genomik DNA vektörler ambalaj içine bulaşıcı λ phages, bacteriophages, CIItanımlaması ile ana E. coli enfeksiyonu- CII mutant frekansını belirlemek için mutantlar seçici koşullar altında ve DNA dizi analizi CII mutasyon spektrum oluşturmak için. Protokol transgenik mouse/fare hücre kültürleri tedavi vitro ilgi bir kimyasal/fiziksel maddesi ile uygulanabilir veya doku/organ karşılık gelen hayvanların vivo içinde test kimyasal/ajan1ile tedavi, 2,4,48,49,50,51,52. λ Select CII tahlil şematik bir sunumunu şekil 1' de gösterilen.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>MO Bio Laboratories, Inc.</td><td>12112-05</td><td>Bacteriological grade</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4337455</td><td>None</td></tr><tr><td>Casein Peptone</td><td>Alfa Aesar</td><td>H26557</td><td>None</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>J. T. Baker</td><td>2124-01</td><td>Powder</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 229-1 / M-13750</td><td>None</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 9724-500</td><td>None</td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>8104</td><td>50 PCR purification reactions</td></tr><tr><td>Sodium Acetate Trihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-15756</td><td>None</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Taq5000&lt;/em&gt; DNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>201207</td><td>None</td></tr><tr><td>Thiamine Hydrochloride</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>2722-57</td><td>None</td></tr><tr><td>Transpack Packaging Extract</td><td>Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp.</td><td>200223</td><td>50 packaging reactions</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 152-1 / EC 201-064-4</td><td>None</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Biosciences</td><td>RC-110</td><td>None</td></tr></tbody></table>

the lambda select cii mutation detection system

Transgenik hayvan modelleri ve mutasyon tespit sistemleri bir dizi memeli hücreleri kanserojen mutagenisitesinin test için geliştirilmiştir. Bunlar transgenik fareler ve Lambda (λ) Select CII mutasyon tespit sistemi mutagenisitesinin deneyler için birçok araştırma grupları tarafından dünya çapında istihdam edilmiştir. Burada, biz transgenik fareler/fareler kültürlü hücrelere uygulanan Lambda seçin CII mutasyon tahlil için detaylı bir protokol tanımlamak veya faiz kimyasal/fiziksel Aracısı ile ilgili hayvan tedavi. Protokol aşağıdaki adımlardan oluşur: (1) yalıtım hücrelerden genomik DNA'ın veya organ/Transjenik hayvanlar dokuların vitro veya vivo içindesırasıyla, bir test karışımla; tedavi (2) (Yani, CII transgene) mutational muhabir gen genomik DNA taşıyan lambda Servisi vektör kurtarılması; (3) bulaşıcı bacteriophages içine kurtarıldı vektörlerin ambalaj; (4) bir ana bilgisayar bakteri hastalık ve seçici koşullar altında indüklenen CII mutasyonlar yayılmasını sağlamak için kültür; ve (5) skorlama CII-mutantlar ve DNA dizi mutasyon spektrum ve CII mutant sıklığı sırasıyla belirlemek için analizi.

Veri dağıtımı bağlı olarak, parametrik ya da non-parametrik testler (spontan mutant Frekanslar karşı indüklenenYani) tedavi ve kontrol grupları arasında CII mutant frekans farkı önemini belirlemek için kullanılır . İndüklenen CII mutant frekansları farklı tedavi grupları arasında karşılaştırılması yapılmış çeşitli tarafından (ikili) uygulanabilir istatistiksel testler. χ2 test veya Varyans analizi (ANOVA), gibi diğe...

Watch this Scientific Journal Video about The Lambda Select cII Mutation Detection System at JoVE.com

The Lambda Select cII Mutation Detection System

Lambda seçin CII mutasyon tespit sistemi

Biz Lambda seçin CII mutasyon tahlil transgenik kemirgenler kültürlü hücrelerdeki veya faiz kimyasal/fiziksel ajanı ile tedavi karşılık gelen hayvanlar için detaylı bir protokol tanımlamak. Bu yaklaşım yaygın kanserojen memeli hücreleri, mutagenisitesinin test etmek için kullanılmıştır.

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of ...

the-lambda-select-cii-mutation-detection-system

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Lambda Select cII Mutation Detection System

7.9K Görüntüleme.  University of Southern California. Biz Lambda seçin CII mutasyon tahlil transgenik kemirgenler kültürlü hücrelerdeki veya faiz kimyasal/fiziksel ajanı ile tedavi karşılık gelen hayvanlar için detaylı bir protokol tanımlamak. Bu yaklaşım yaygın kanserojen memeli hücreleri, mutagenisitesinin test etmek için kullanılmıştır.

Video: The Lambda Select cII Mutation Detection System

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Genetik

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.

This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.

Site Yönetmen Spin Etiketleme ve pentameric ligand-kapılı iyon Kanallarının EPR Spektroskopik Çalışmaları

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Kimya

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a polymorphic cluster of genes on chromosome 19. Their best-characterized ligands are the human leukocyte antigen (HLA) molecules that are encoded within the major histocompatibility complex (MHC) locus on chromosome 6. There is substantial evidence that they play a significant role in immunity, reproduction, and transplantation, making it crucial to have techniques that can accurately genotype them. However, high-sequence homology, as well as allelic and copy number variation, make it difficult to design methods that can accurately and efficiently genotype all KIR genes. Traditional methods are usually limited in the resolution of data obtained, throughput, cost-effectiveness, and the time taken for setting up and running the experiments. We describe a method called quantitative KIR semi-automated typing (qKAT), which is a high-throughput multiplex real-time polymerase chain reaction method that can determine the gene copy numbers for all genes in the KIR locus. qKAT is a simple high-throughput method that can provide high-resolution KIR copy number data, which can be further used to infer the variations in the structurally polymorphic haplotypes that encompass them. This copy number and haplotype data can be beneficial for studies on large-scale disease associations, population genetics, as well as investigations on expression and functional interactions between KIR and HLA.

Quantitative killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) semi-automated typing (qKAT) is a simple, high-throughput, and cost-effective method to copy number type KIR genes for their application in population and disease association studies.

qKAT: nicel Semi-automated yazmaktan katil hücreli immünglobulin benzeri reseptör gen

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the TILLING system has less applicability for insertion/deletion (Indel) detection and traditional TILLING needs more complex steps, like CEL I nuclease digestion and gel electrophoresis. To improve the throughput and selection efficiency, and to make the screening of both Indels and single base substitions (SBSs) possible, a new high-resolution melting (HRM)-based TILLING system is developed. Here, we present a detailed HRM-TILLING protocol and show its application in mutation screening. This method can analyze the mutations of PCR amplicons by measuring the denaturation of double-stranded DNA at high temperatures. HRM analysis is directly performed post-PCR without additional processing. Moreover, a simple, safe and fast (SSF) DNA extraction method is integrated with HRM-TILLING to identify both Indels and SBSs. Its simplicity, robustness and high throughput make it potentially useful for mutation scanning in rice and other crops.

In this article, we present the protocol that is described as high-resolution melting analysis (HRM)-based Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING). This method utilizes fluorescence changes during the melting of the DNA duplex and is suitable for high-throughput screening of both insertion/deletion (Indel) and single base substition (SBS).

Pirinç Bir TILLING Popülasyonyüksek Çözünürlükte Erime mutasyonları belirlenmesi

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

Saf Hematopoetik kök / progenitör hücrelerin DNA mutasyonları belirlenmesi

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

InSET: A Novel Tool for Unbiased Genome-Wide Functional Element Discovery

Identification of Functionally-Relevant Lentivirus Integration Sites in an Insertional Mutagenesis Cell Library

The extent of functional sequences within the human genome is a pivotal yet debated topic in biology. Although high-throughput reverse genetic screens have made strides in exploring this, they often limit their scope to known genomic elements and may introduce non-specific effects. This underscores the urgent need for novel functional genomics tools that enable a deeper, unbiased understanding of genome functionality. This protocol introduces the Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), a method for identifying lentivirus integration sites within a lentivirus-based insertional mutagenesis cell library. InSET facilitates the capture of genome-wide lentiviral integration sites, with next-generation sequencing used to detect and quantify flanking sequences. InSET's design enables the analysis of integration site abundance variations in phenotypic screens on a large scale, establishing it as a robust tool for forward genetics and for identifying functional genomic elements. A key benefit of InSET is its capacity to reveal previously unidentified genomic elements, including novel functional exons of both protein-coding and non-coding RNAs, independent of prior annotation. Overall, InSET holds significant value in studying the intricate complexity of the human genome and transcriptome, where many genomic elements await functional characterization.

Insertional mutagenesis is an essential tool in forward genetics for identifying functional genomic elements. Here, we describe the Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), a method for detecting lentivirus integration sites within a lentivirus-based insertional mutagenesis cell library.

The extent of functional sequences within the human genome is a pivotal yet debated topic in biology. Although high-throughput reverse genetic screens ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Biyoloji

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

The early detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by citrus growers facilitates early intervention and prevents the spread of disease. A simple method for rapid and portable Huanglongbing (HLB) diagnosis is presented here that combines recombinase polymerase amplification and a fluorescent reporter utilizing the nuclease activity of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 12a (CRISPR-Cas12a) system. The sensitivity of this technique is much higher than PCR. Furthermore, this method showed similar results to qPCR when leaf samples were used. Compared with conventional CLas detection methods, the detection method presented here can be completed in 90 min and works in an isothermal condition that does not require the use of PCR machines. In addition, the results can be visualized through a handheld fluorescent detection device in the field.

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

In this work, a rapid, sensitive, and portable detection method for Candidatus Liberibacter asiaticus based on recombinase polymerase amplification combined with CRISPR-Cas12a was developed.

CRISPR-Cas12a ile Kombine Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonu Kullanılarak Sahada Konuşlandırılabilir Candidatus Liberibacter asiaticus Tespiti

The early detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by citrus growers facilitates early intervention and prevents the spread of disease. A ...

Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations

Structural variants (SVs) (i.e., deletions, insertions, duplications, and inversions) are now known to play an important role in phenotypic variation, and consequently in processes such as disease determination or adaptation to a new environment. However, single-nucleotide variants receive much more attention than SVs, probably because they are easier to detect, and their phenotypic effects are easier to predict. The development of short- and long-read deep sequencing technologies have strongly improved the detection of SVs, but the quantification of their frequency from pooled sequencing (poolseq) data is still technically complex and expensive.
Here, we present a rather simple and inexpensive method, which allows researchers to follow the dynamics of SV allele frequency. As an example of application, we follow the frequency of an insertion sequence (IS) insertion in experimental evolution populations of bacteria. This method is based on the design of triplets of primers around the structural variant borders, such that the amplicons produced by amplification of the wild-type (WT) and derived alleles differ in size by at least 5%, and that their amplification efficiency is similar. The quantity of each amplicon is then determined by parallel capillary electrophoresis and normalized to a calibration curve. This method can be easily extended to the quantification of the frequency of other structural variants (deletions, duplications, and inversions) and to pool-seq approaches of natural populations, including within-patient pathogen populations.

We developed a cost-effective method to follow non-single nucleotide polymorphism allele dynamics that can easily be adapted to experimental evolution frozen archives. A triplet PCR technique was coupled with automated parallel capillary electrophoresis to quantify the relative frequency of an insertion allele over the course of experimental evolution.

Deneysel Olarak Evrimleşmiş Popülasyonlarda Yapısal Varyantların Dinamiklerini Takip Etmek

Structural variants (SVs) (i.e., deletions, insertions, duplications, and inversions) are now known to play an important role in phenotypic variation, and ...

DNA Virus Detection System Based on RPA-CRISPR/Cas12a-SPM and Deep Learning

We report a fast, easy-to-implement, highly sensitive, sequence-specific, and point-of-care (POC) DNA virus detection system, which combines recombinase polymerase amplification (RPA) and CRISPR/Cas12a system for trace detection of DNA viruses. Target DNA is amplified and recognized by RPA and CRISPR/Cas12a separately, which triggers the collateral cleavage activity of Cas12a that cleaves a fluorophore-quencher labeled DNA reporter and generalizes fluorescence. For POC detection, portable smartphone microscopy is built to take fluorescent images. Besides, deep learning models for binary classification of positive or negative samples, achieving high accuracy, are deployed within the system. Frog virus 3 (FV3, genera Ranavirus, family Iridoviridae) was tested as an example for this DNA virus POC detection system, and the limits of detection (LoD) can achieve 10 aM within 40 min. Without skilled operators and bulky instruments, the portable and miniature RPA-CRISPR/Cas12a-SPM with artificial intelligence (AI) assisted classification shows great potential for POC DNA virus detection and can help prevent the spread of such viruses.

We present a protocol that combines recombinase polymerase amplification with a CRISPR/Cas12a system for trace detection of DNA viruses and builds portable smartphone microscopy with an artificial intelligence-assisted classification for point-of-care DNA virus detection.

RPA-CRISPR/Cas12a-SPM ve Derin Öğrenmeye Dayalı DNA Virüs Tespit Sistemi

We report a fast, easy-to-implement, highly sensitive, sequence-specific, and point-of-care (POC) DNA virus detection system, which combines recombinase ...