Tüm meslektaşlarımızın katkıları ve ortak çalışanlar, sonuçlar için bu el yazması (görsel amacıyla) sevk edilmiştir orijinal çalışmalarımız için kabul etmek istiyoruz. Yazarların iş hibe Ulusal Enstitüsü diş ve ulusal sağlık Enstitüleri (1R01DE026043) AB için kraniyofasiyal araştırma ve California Tobacco-Related hastalığı araştırma programı için AB (Üniversitesi tarafından desteklenmektedir TRDRP-26IR-0015) ve ST (TRDRP-25IP-0001). Sponsorlar çalışmanın çalışma tasarım, veri toplama, veri analizi, veri yorumu, rapor yazma veya yayın için göndermek için karar herhangi bir rolü yoktu.

1. fare embriyonik fibroblastlar genomik DNA izolasyonu
Not: Birincil fare embriyonik fibroblastlar göre yayımlanmış protokolü53C57BL/6 genetik arka plan ile BB transgenik fareler türetilen embriyo etkilenmezsiniz. Bu iletişim kuralı için başlangıç materyali 1 x 106 -bileşik karşı test denetimi ile tedavi 1 x 107 embriyonik fibroblast hücreleri oluşur. Hasat ve standart yöntemlerle bu hücrelerin sayma başvurular10,54,55açıklanmıştır.
<ol><li>Hazırlamak bir (0,3 M Sükroz, 60 mM KCl, 15 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0,5 mM spermidine, 0.15 mM spermine ve 2 mM EDTA) tampon, tampon B (150 mM NaCl ve 5 mM EDTA, pH 7.8) ve C (20 mM Tris-HCl, pH 8.0 arabellek 20 mM NaCl, 20 mM EDTA ve % 1 SDS) peşin ve en çok bir yıl54,55(RT) oda sıcaklığında koru.</li>
	<li>Geniş bir yelpazede kullanarak yukarı ve aşağı üst üste pipetting tarafından 15 mL konik santrifüj tüpü A 1000 µL pipet ucu delik 2-4 mL arabellek hücrelerde resuspend.</li>
	<li>Bir birim (2-4 mL) arabellek A içeren %1 octylphenoxypolyethoxyethanol (örneğin, Nonidet P40) ekleyin cam serolojik pipet kullanarak.</li>
	<li>Buz 5 min için tüp kuluçkaya.</li>
	<li>1000 x g RT., 5 min için de tüp santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Süpernatant atın ve Pelet 10-15 mL arabellek kullanarak bir cam serolojik pipet ile yıkayın.</li>
	<li>Pelet 2-4 mL arabellekte B. resuspend</li>
	<li>Bir birim (2-4 mL) arabellek C içeren 600 µg/mL İndinavir K. Ekle</li>
	<li>Tüp 37 ° C'de 3 h için kuluçkaya</li>
	<li>RNase A 100 µg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin.</li>
	<li>Tüp bir ek 1 h 37 ° C'de için kuluçkaya</li>
	<li>Bir birim (2-4 mL) fenol ekleyin (0.1 doymuş M Tris-HCl, pH 8.0):chloroform:isoamyl alkol (25:24:1 vol/vol). Not: Fenol ağır sağlık tehlike oluşturabilir ve olağanüstü dikkatle ele alınması gerekir. Fenol cilt için son derece korozif ve içinden kolayca emilir ve diğer efektler sergiler. Fenol, işleme her zaman kullandığınızda double gloving, koruyucu gözlük giymek ve kimyasal duman mahallede iş.</li>
	<li>İyi bir tüp rotator 4 ° C'de 5 min için tüp ters çevirme tarafından mix</li>
	<li>1000 x g 4 ° C'de 5 min için de tüp santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Sulu faz (üst katman) için yeni bir tüp cam serolojik pipet kullanarak kaldırın.</li>
	<li>Fenol: kloroform: izoamil alkol ayıklama 1-3 kat sulu faz açıktır ve arabirimidir artık bulanık kadar yineleyin.</li>
	<li>1/10 birim (200-400 µL) 3 M sodyum asetat, pH 5.2 ekleyin.</li>
	<li>2.5 hacmi (5-10 mL) % 100 etanol (soğuk) ekleyin ve 2-3 dakika için elle tüpü yavaşça tersine çevirin.</li>
	<li>Bir cam kanca ile DNA biriktirmek ve %70 1 – 5 mL içeren yeni bir tüp transferi etanol ve iyice yıkayın. Alternatif olarak, DNA cips ve %70 1 – 5 mL ile iyice yıkayın için 4 ° C yüksek hızda (3.500 x g) tüp santrifüj kapasitesi etanol.</li>
	<li>Yüksek hızda (3.500 x g) tüp RT santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırmak ve 10-15 dk için DNA kuruması.</li>
	<li>10-100 µL TE arabellek (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) DNA'daki dağıtılması ve 4 ° c (için bir ay kısa depolama) veya (daha uzun süre depolama)-20 ° C'de depolayın. λ Select CII tahlil için DNA'ın konsantrasyonu en uygun olduğunu 0.5-1.0 µg/µL (TE arabellekte)56.</li>
</ol>2. Vitro ambalaj tepki
<ol><li>Bir ambalaj tepki ~ 5 µg genomik DNA ekleyin (son hacim: 8 – 12 µL, genomik DNA Bölüm 1 ' fare embriyonik fibroblastlar tedavi vitro bileşik bir testiyle veya denetiminden izole) ilk içeren bir microcentrifuge Tube reaksiyon mix (~ 10 µL). Not: İçinde-ev hazır veya piyasada bulunan λ ambalaj özleri farklı laboratuvarlarda kullanılır. Ticari ambalaj özü kiti burada56 kullanılan (bkz. Tablo reçetesi) kırmızı tüpler ilk tepki mix (~ 10 µL) ve mavi tüpler bulunan ikinci reaksiyon mix (en az 5 tepkiler ~ 70 µL).</li>
	<li>30 ° C'de 90 dk için tüp kuluçkaya</li>
	<li>Gerekli birim (~ 12 µL) tüp ikinci reaksiyon karışımı ekleyin.</li>
	<li>Tüp bir ek 90 dk 30 ° C'de için kuluçkaya</li>
	<li>
SM arabellek 1.1 mL tüp ekleyin. Not: Bu çözüm (Yani, ambalaj tepki karışımı) 1 mL λ CIIeleme için kullanılan-mutant. Geri kalan titering için kullanılır.<ol>
<li>SM arabellek 5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4.7H2O, 50 mL karıştırarak hazırlayın 1 M Tris-HCl (pH 7.5) ve 5 mL %2 (w/v) jelatin. DH2O son hacmi 1 litre, otoklav ilâ 1 yıl için oda sıcaklığında 30 dk. mağaza için ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Girdap 10 için paketlenmiş DNA örneği içeren tüp RT (dinç vortexing), s.</li>
	<li>Nabız microcentrifuge ve buz üzerinde mağaza tüpte kullanıma hazır kadar spin. Örnek ambalaj aynı gün içerisinde kullanılacak gitmiyor, kloroform mL paketlenmiş DNA'ın başına 50 µL ekleyerek her örnek, girdap yavaşça ve 2 hafta için 4 ° C'de depolayın.</li>
</ol>3. E. coli G1250 bakteriyel kültür hazırlama
<ol><li>
En az iki gün önce kaplama, Escherichia coli (e.coli) G1250 TB1-sefaloridin agar Tabaklarda gelen birkaç bakteriyel çizgi plakaları olun.
	<ol>
<li>TB1-sefaloridin Ağar kaplamalar aşağıdaki gibi hazırlayın. 5.0 g NaCl, 10,0 g kazein pepton ve 12,0 g agar karıştırın. 800 mL dH2O. eklemek 1 mL %0.1 tiamin hidroklorür ekleyin. PH 7.0 NaOH veya HCl. Ekle ile ayarlamak dH2O son hacmiyle 1 litre.</li>
		<li>Mix iyi ve otoklav 30 dk. 55 ° C'ye soğutmak için izin ver 50.0 mg sefaloridin ekleyip karıştırın. Steril 100-mm petri yemekler (çanak başına 20-25 mL) içine dökün. Tabaklar 4 ° c ilâ iki hafta için saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bakteriyel çizgi plakaları bir sabit 30 ° C kuluçka için en az 24 saat kuluçkaya.</li>
	<li>
Bir gün önce kaplama, TB1 sıvı orta 10 mL % 20 (w/v) maltoz-1 M MgSO4 çözüm bir steril 50 mL vidalı kapak konik tüp 100 µL ile birleştirir.
	<ol>
<li>TB1 sıvı orta şekilde hazırlayın. Mix 5.0 g NaCl ve 10.0 g kazein pepton, 800 mL dH2O, 1 mL %0.1 tiamin hidroklorür, ekleyebilir ve 7.0 NaOH veya HCl pH ayarlayabilirsiniz. Mix iyi ve otoklav 30 dakika süreyle RT orta üç aya kadar saklamak, sonra dH2O son hacmi 1 litre için ekleyin.</li>
		<li>%20 (w/v) maltoz-1 M MgSO4 aşağıdaki gibi hazırlayın. Mix 20.0 g maltoz ve 24.6 g MgSO4. 7H2O, o zaman 100 mL nihai bir birime dH2O ekleyin. Filtre sterilize ve 6 aya kadar 4 ° C'de depolayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sömürgeler steril inoculating döngü56kullanarak bakteriyel çizgi plaka ile sıvı orta aşılamak.</li>
	<li>Sıvı kültüründe gecede 30 ° C ile dinç (250 – 300 rpm) sallayarak kuluçka sallayarak kuluçkaya.</li>
	<li>Kaplama günde konik tüp G1250 sıvı kültür 1.500 x g RT bakteri hücreleri cips, 10 min için de içeren santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant atın ve hücre Pelet 10 mL 10 mM MgSO4resuspend.</li>
	<li>1:10 Absorbans ölçmek seyreltme hücre süspansiyon, bir UV-VIS Spektrofotometre (örneğin, 100 µL hücre süspansiyon + 900 µL 10 mM MgSO4)56kullanarak dalga boyu 600 nm.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 0,5 ile 10 mM MgSO4son OD600 oranında seyreltin. G1250 E. coli OD600 ile hazırlanan süspansiyon = 0,5 'G1250 kaplama Kültür' adlandırılır.</li>
	<li>G1250 kaplama kültür buza kapaklarý takýlý içinde 1-2 h.</li>
</ol>4. kaplama paketlenmiş DNA örnekleri
<ol><li>
Bir paket DNA örneği on altı steril 14 x 100 mm2 yuvarlak alt tüpler ve on altı TB1 Ağar kaplamalar hazırlayın. 10'dan her küme için tarama ve altı titering (titresi 20 3) ve üç titresi 100 için kullanılacaktır.
	<ol>
<li>TB1 Ağar kaplamalar aşağıdaki gibi hazırlayın. Mix 5.0 g NaCl, 10,0 g kazein pepton ve 12,0 g Agar, sonra 800 mL dH2O ve 1 mL %0.1 tiamin hidroklorür ekleyin. 7.0 NaOH veya HCl pH ayarlayabilir ve dH2O 1 L. son bir hacim için ekleyebilirsiniz</li>
		<li>Mix iyi ve otoklav 30 dk. 55 ° C-cool, sonra steril 100 mm Petri yemekler (çanak başına 20-25 mL) içine dökün karışımı sağlar. Plakayı 4 ° c ilâ iki hafta için saklayın. Not: En az 24 kullanılmadan önce s TB1 Ağar kaplamalar hazırlanmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her yuvarlak alt tüpün içine G1250 kaplama kültürünün aliquot 200 µL.</li>
	<li>
Titering için1: 100 seyreltme paketlenmiş DNA örneği yapmak ve de vortexing tarafından (Yani, 10 µL paketlenmiş DNA örneği + 990 µL SM arabellek) karıştırın.</li>
	<li>1: 100 seyreltme 20 µL her üç titresi 20 tüpler için ekleyin.</li>
	<li>1: 100 seyreltme 100 µL her üç titresi 100 borular için ekleyin.</li>
	<li>
Tarama için100 µL Ekle 'su katılmamış ' her on tarama tüplerinin paketlenmiş DNA örneği.</li>
	<li>Tüm titering ve tarama tüpler işlemek (2 x 3 + 10 = 16 tüpler), aşağıdaki gibi: mix de tarafından yaklaşık 10 için vortexing s ve sonra ana bilgisayarın E. coli phages absorbe sağlamak 30 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>
Mikro dalgada erimiş TB1 kontör agar (55 ° C için soğutmalı) her titresi veya tüp, eleme hemen vortexing tarafından (), karışımı yavaşça 2.5 mL ekleyin ve uygun titresi dökme veya TB1 Ağar kaplamalar eleme.
	<ol>
<li>TB1 en iyi agar aşağıdaki gibi hazırlayın. Mix 5.0 g NaCl, 10,0 g kazein pepton ve 7.0 g Agar, sonra 800 mL dH2O. eklemek 1 mL %0.1 tiamin hidroklorür ekleyin, sonra 7.0 NaOH veya HCl pH ayarlama. Son olarak, dH2O son hacmi 1 litre için ekleyin.</li>
		<li>İyi ve otoklav 20-25 dk. mağaza oda sıcaklığında üç aya kadar karıştırın.</li>
		<li>Kullanım önce hazır TB1 en iyi agar bir mikrodalga eritmek, iyice karıştırın ve bir su banyosu içinde 55 ° C için soğumasını bekleyin. Not: Erimiş ve soğutulmuş TB1 üst her titresi veya tarama tüp içeriği eklenir ve karıştırma sonra uygun titresi veya tarama TB1 agar tabak dökülür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>15-30 dakika oda sıcaklığında, yoğunlaşma önlemek için Aralık kapaklı stand plakaları ver.</li>
	<li>Tabakları ters çevir ve sabit 24 ° C kuluçka makinesine on tarama tabak yerleştirin ve 46-48 h (Yani, seçici koşullar) ve sabit 37 ° C kuluçka altı titresi plakaları için kuluçkaya ve 24 saat kuluçkaya / (Yani, bir gecede Seçici olmayan koşullar). Not: kalite güvence ve sonuçları standardizasyonu için bilinen mutant frekans ile wildtype ve mutant CII karışımı içeren ticari olarak kullanılabilir denetim fajının çözümler paketlenmiş DNA örnekleri kaplama ve tüm tahlil56çalışır.</li>
</ol>5. inceleme titresi ve eleme plakaları CII Mutant frekansı belirlemek için
<ol><li>37 ° C'de 24 h/gecede kuluçka sayısı plaklar sayısı her üç titresi 20 tabakalar ve titresi 100 tabak içinde oluşmuş. Plaklar daha kolay tanımlamak için plaka beyaz bir ışık kutusunun yanındaki ve karanlık bir arka plan (bkz. Şekil 2) kaldırıldı kapak ile tutun.</li>
	<li>Plaklar sayısı ortalama (ortalama) sayılan titresi 20 tabak ve titresi 100 tabak her kümede yapmak (her triplicate).</li>
	<li>Ortalama 50-200 plaklar plaka set başına dizi yakın düşüyor titresi plakaları kümesinden seçin.</li>
	<li>Aşağıdaki gibi on tarama levhalar yaylıdır ekranlı plaklar toplam sayısını hesaplar: Toplam ekranlı plaklar (ortalama sayısı plaklar titresi plakaları ÷ seyreltme µL sayısı seçilen titresi plaka kullanılan seçilen küme) = seyreltme faktörü x x µL plaka [100 µL/plaka] eleme başına paketlenmiş DNA örneği sayısı x tabak [10] tarama sayısı. Not: Örneğin, plaklar titresi 20 plakaların kümedeki plaka başına ortalama sayısı 128'dir ve 478 titresi 100 plakaların kümedeki karşılık gelen sayıdır, sayı 128 ekranlı plaklar toplam sayısı hesaplanması için kullanılır , aşağıdaki gibi: (128 ÷ 20) x 100 [µL/plaka] x 10 [plakaları] x 100 [seyreltme faktörü] 640.000 = Bu ortalama titresi 20 plakaları veya titresi 100 Kaplamalar, sayıları sırasıyla temel alıyorsa plaklar ortalama sayısı 5.000 veya 1.000, teksir makinesi için eşdeğerdir.</li>
	<li>24 ° c 46-48 h kuluçka plaklar (Bölüm 5. 1'sağlanan yönergeleri izleyin) on tarama plakaları oluşan toplam sayısını saymak. Not: CII mutant frekans tarama levhalar yaylıdır oluşan plaklar ile ekranlı plaklar toplam sayısı toplam sayısı bölünerek hesaplanır. Yukarıdaki örnekte, sayılan plaklar toplam sayısı on tarama levha kullanarak 112, CII mutant frekans bu DNA örneği için 112 ÷ 640.000 = 17,5 x 10-5olacaktır.</li>
</ol>6. Putative λ CII mutantlar doğrulanması, PCR güçlendirme ve DNA Sekanslama
<ol><li>Steril, geniş-geçişli damlalıklı ucu ile söz konusu plak çekirdek ve bu 500 µL steril SM arabelleği içeren bir steril microcentrifuge tüpüne sınırdışı (yukarı ve aşağı pipetting tarafından).</li>
	<li>Oda sıcaklığında en az 2 h için kuluçkaya veya 4 ° C'de fajının parçacıklar agar elute izin vermek için bir gecede takın.</li>
	<li>Bir steril 14 x 100 mm2 yuvarlak alt tüp G1250 kaplama kültürünün 200 µL özlü fajının çözüm 1 µL ile karıştırın ve RT., 30 dk için kuluçkaya</li>
	<li>2,5 mL 55 ° C erimiş TB1 üst agar kullanarak örnek plaka ve plaka 24 ° c 46-48 h (seçici koşulları), bölümler 4,8-4,10 içinde açıklandığı gibi kuluçkaya.</li>
	<li>İkincil plaklar oluşmuş bir pipet ucu bir tek iyi izole doğrulanmış λ CIIdikkatle almaya kılabilmesi-mutant plak (alt agar dokunmaktan kaçının). Not: sözde CII mutant plaklar Replating iki amaca hizmet eder: (i) eserler kaplama bazen yanlış olabilir küçük boyutlu plaklar için; ve (ii) bir tarama tabaktan alınan bir özel çekirdek mutant olmayan phage(s) ile birlikte bir mutant fajının içerebilir. Düşük yoğunluklu replating üzerinden ikincil plaklar PCR ve sonraki DNA dizi analizi için kirlenmemiş bir mutant şablonu sağlar.</li>
	<li>Plak yukarı ve aşağı pipetting tarafından 25 µL çift distile su içeren bir microcentrifuge tüp aktarın.</li>
	<li>Tüp 5 min için kaynar suda koyun.</li>
	<li>Maksimum hızda (18.000 x g) RT. 3 dakika santrifüj kapasitesi</li>
	<li>10 µL süpernatant, hemen 40 µL PCR mastermix reaktifleri son konsantrasyonları olan 1 x Taq PCR tampon, 10 pmol her ileriye ve geriye doğru astar, her dNTP 12.5 nmol içeren yeni bir microcentrifuge tüp transferi ve 2.5 U Taq DNA polimeraz. Not: İleriye ve geriye doğru astar aşağıdaki gibidir: 5'-CCACACCTATGGTGTATG-3' (-68 -50 CII göre için başlamak kodon pozisyonlar) ve 5'-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3' (+345 365 CII başlama kodonu göre için sırasıyla pozisyonlar).</li>
	<li>Aşağıdaki Bisiklete binme parametrelerini kullanarak şablon yükseltmek: 3 dk denatürasyon 95 ° C'de 30 30 döngüsü tarafından takip s 95 ° c, 1 dk. 60 ° C'de ve uzantısına sahip bir son 72 ° C'de 10 dk 72 ° C'de 1 dk</li>
	<li>CII gen içeren ve piyasada bulunan PCR arıtma kitleri, kullanarak bölge kanat 432 bp PCR ürünü üreticinin yönergelerine göre arındırmak.</li>
	<li>DNA sıralama bir uygun sıralama platformu kullanarak gerçekleştirmek ve mutasyonlar CII transgene algılamak için elde edilen DNA dizilerinin analiz (aşağıdaki nota bakın). Not: Bu en iyi yazılım, web tabanlı T-kahve sıra hizalama server gibi kullanılarak başvuru CII sırası ile hizalama tarafından sağlanır. Program kullanımı hakkında yönergeler için ziyaret edin: <a href="http://tcoffee.crg.cat/">http://tcoffee.crg.cat/</a>
</li>
</ol>

Tüm yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.

λ Select CII tahlil organ/dokulardan BB kemirgenler3türetilmiş hücre genomik DNA kurtarıldı CII transgene mutasyonların tespiti için kullanılır. Bu Transjenik hayvanlar genom CII taşıdığı genetik entegre λLIZ Servisi vektör, birden çok tandem kopyalarını içerir (294 bp) ve lacI (1,080 bp) transgenes, mutational muhabir gen1, 2 , 25. λ Select CI...

Transgenik hayvan modelleri ve mutasyon tespit sistemleri geniş bir memeli hücreleri kanserojen mutagenisitesinin test için geliştirilmiştir. Bunlar transgenik Big Blue (bundan sonra BB adlandırılır) fareler ve λ Select CII mutasyon tespit sistemi mutagenisitesinin deneyler için bu grup ve birçok diğer araştırma grupları dünya çapında1,2tarafından istihdam edilmiştir, 3,4,5,6,7,8,9. Son 16 yıldır, biz bu Transjenik hayvanlar kullanarak çeşitli kimyasal ve/veya fiziksel ajanların mutajenik etkileri araştırdık veya onların karşılık gelen embriyonik fibroblast hücre kültürlerinde bir test karışımı ile tedavi ve daha sonra analiz λ Select CII tahlil ve DNA sıralama, sırasıyla10,11,12,13,14 CII transgene genotip ve fenotip , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. bu Transjenik hayvanlar genom kromozom 4 Çoklu kopya kafa kuyruk concatemer1,2,25üzerinde entegre bir bakteriyofaj λ Servisi vektör (λLIZ) içerir. ΛLIZ Servisi vektör iki mutational muhabir gen taşır yani lacI ve CII transgenes1,2,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45 , 46 , 47. λ Select CII tahlil λLIZ Servisi vektörel çizimler kurtarma organ/dokulardan Transjenik hayvanlar1,2,25 türetilmiş hücre genomik DNA dayanır . Kurtarılan λLIZ Servisi vektörel çizimler sonra bir göstergesi ana Escherichia colibulaşmasını yetenekli λ fajının zihinlerine paketlenmiştir. Daha sonra virüs bulaşan bakteriler puanlama ve CII transgene1,3mutasyon analizi için izin vermek için seçici koşullar altında yetiştirilmektedir.
Burada, biz hücreleri/Transjenik hayvanlar tedavi vitroorganlarının genomik DNA izolasyonu oluşur λ Select CII tahlil için detaylı bir protokol tarif /vivo λLIZ test bileşik, alımı ile olan yakındaki vektörel çizimler genomik DNA vektörler ambalaj içine bulaşıcı λ phages, bacteriophages, CIItanımlaması ile ana E. coli enfeksiyonu- CII mutant frekansını belirlemek için mutantlar seçici koşullar altında ve DNA dizi analizi CII mutasyon spektrum oluşturmak için. Protokol transgenik mouse/fare hücre kültürleri tedavi vitro ilgi bir kimyasal/fiziksel maddesi ile uygulanabilir veya doku/organ karşılık gelen hayvanların vivo içinde test kimyasal/ajan1ile tedavi, 2,4,48,49,50,51,52. λ Select CII tahlil şematik bir sunumunu şekil 1' de gösterilen.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>MO Bio Laboratories, Inc.</td><td>12112-05</td><td>Bacteriological grade</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4337455</td><td>None</td></tr><tr><td>Casein Peptone</td><td>Alfa Aesar</td><td>H26557</td><td>None</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>J. T. Baker</td><td>2124-01</td><td>Powder</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 229-1 / M-13750</td><td>None</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 9724-500</td><td>None</td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>8104</td><td>50 PCR purification reactions</td></tr><tr><td>Sodium Acetate Trihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-15756</td><td>None</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Taq5000&lt;/em&gt; DNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>201207</td><td>None</td></tr><tr><td>Thiamine Hydrochloride</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>2722-57</td><td>None</td></tr><tr><td>Transpack Packaging Extract</td><td>Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp.</td><td>200223</td><td>50 packaging reactions</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 152-1 / EC 201-064-4</td><td>None</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Biosciences</td><td>RC-110</td><td>None</td></tr></tbody></table>

the lambda select cii mutation detection system

Transgenik hayvan modelleri ve mutasyon tespit sistemleri bir dizi memeli hücreleri kanserojen mutagenisitesinin test için geliştirilmiştir. Bunlar transgenik fareler ve Lambda (λ) Select CII mutasyon tespit sistemi mutagenisitesinin deneyler için birçok araştırma grupları tarafından dünya çapında istihdam edilmiştir. Burada, biz transgenik fareler/fareler kültürlü hücrelere uygulanan Lambda seçin CII mutasyon tahlil için detaylı bir protokol tanımlamak veya faiz kimyasal/fiziksel Aracısı ile ilgili hayvan tedavi. Protokol aşağıdaki adımlardan oluşur: (1) yalıtım hücrelerden genomik DNA'ın veya organ/Transjenik hayvanlar dokuların vitro veya vivo içindesırasıyla, bir test karışımla; tedavi (2) (Yani, CII transgene) mutational muhabir gen genomik DNA taşıyan lambda Servisi vektör kurtarılması; (3) bulaşıcı bacteriophages içine kurtarıldı vektörlerin ambalaj; (4) bir ana bilgisayar bakteri hastalık ve seçici koşullar altında indüklenen CII mutasyonlar yayılmasını sağlamak için kültür; ve (5) skorlama CII-mutantlar ve DNA dizi mutasyon spektrum ve CII mutant sıklığı sırasıyla belirlemek için analizi.

Veri dağıtımı bağlı olarak, parametrik ya da non-parametrik testler (spontan mutant Frekanslar karşı indüklenenYani) tedavi ve kontrol grupları arasında CII mutant frekans farkı önemini belirlemek için kullanılır . İndüklenen CII mutant frekansları farklı tedavi grupları arasında karşılaştırılması yapılmış çeşitli tarafından (ikili) uygulanabilir istatistiksel testler. χ2 test veya Varyans analizi (ANOVA), gibi diğe...

Watch this Scientific Journal Video about The Lambda Select cII Mutation Detection System at JoVE.com

The Lambda Select cII Mutation Detection System

Lambda seçin CII mutasyon tespit sistemi

Biz Lambda seçin CII mutasyon tahlil transgenik kemirgenler kültürlü hücrelerdeki veya faiz kimyasal/fiziksel ajanı ile tedavi karşılık gelen hayvanlar için detaylı bir protokol tanımlamak. Bu yaklaşım yaygın kanserojen memeli hücreleri, mutagenisitesinin test etmek için kullanılmıştır.

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of ...

the-lambda-select-cii-mutation-detection-system

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Lambda Select cII Mutation Detection System

7.8K Görüntüleme.  University of Southern California. Biz Lambda seçin CII mutasyon tahlil transgenik kemirgenler kültürlü hücrelerdeki veya faiz kimyasal/fiziksel ajanı ile tedavi karşılık gelen hayvanlar için detaylı bir protokol tanımlamak. Bu yaklaşım yaygın kanserojen memeli hücreleri, mutagenisitesinin test etmek için kullanılmıştır.

Video: The Lambda Select cII Mutation Detection System

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific molecular profiles of a tumor may predict responsiveness to therapeutic agents or provide knowledge about prognosis. At our institution a tumor genotyping program was established as part of routine clinical care, screening both hematologic and solid tumors for a wide spectrum of mutations using two next-generation sequencing (NGS) panels: a custom, 33 gene hematological malignancies panel for use with peripheral blood and bone marrow, and a commercially produced solid tumor panel for use with formalin-fixed paraffin-embedded tissue that targets 47 genes commonly mutated in cancer. Our workflow includes a pathologist review of the biopsy to ensure there is adequate amount of tumor for the assay followed by customized DNA extraction is performed on the specimen. Quality control of the specimen includes steps for quantity, quality and integrity and only after the extracted DNA passes these metrics an amplicon library is generated and sequenced. The resulting data is analyzed through an in-house bioinformatics pipeline and the variants are reviewed and interpreted for pathogenicity. Here we provide a snapshot of the utility of each panel using two clinical cases to provide insight into how a well-designed NGS workflow can contribute to optimizing clinical outcomes.

This manuscript describes clinical protocols for two next-generation sequencing panels. One panel interrogates hematologic malignancies while the other panel targets genes commonly mutated in solid tumors. Molecular classification of driver mutations in human malignancies offers valuable prognostic and predictive information.

Katı ve Sıvı Tümörlerinde harekete geçirici Mutasyonlar Tespiti için Yeni Nesil Dizi

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Kanser Araştırmaları

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging resistance mutations during therapy, or when patients have few circulating tumor cells. Wild-type blocking PCR followed by sequencing analysis offers high sensitivity, flexibility, and simplicity as a methodology for detecting these low frequency mutations. By adding a custom designed locked nucleic acid oligonucleotide to a new or previously established conventional PCR based sequencing assay, sensitivities of approximately 1 mutant allele in a background of 1,000 WT alleles can be achieved (1:1,000). Sequencing artifacts associated with deamination events commonly found in formalin fixed paraffin embedded tissues can be partially remedied by the use of uracil DNA glycosylase during extraction steps. The optimized protocol here is specific for detecting MYD88 mutation, but can serve as a template to design any WTB-PCR assay. Advantages of the WTB-PCR assay over other commonly utilized assays for the detection of low frequency mutations including allele specific PCR and real-time quantitative PCR include fewer occurrences of false positives, greater flexibility and ease of implementation, and the ability to detect both known and unknown mutations.

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

Yabani tip PCR Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonlar Tespiti için oldukça hassas bir yöntem olarak doğrudan bölme imkanı Kombine Engelleme

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Genetik

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. However, the application of this method is challenging due to its low sensitivity in analyzing the trace amount of ctDNA in the blood. Furthermore, the method may generate false positive and negative results from this sequencing and subsequent analysis. To improve the feasibility and reliability of ctDNA detection in the clinic, here we present a technique which enriches rare mutations for sequencing, Enrich Rare Mutation Sequencing (ER-Seq). ER-Seq can distinguish a single mutation out of 1 x 107 wild-type nucleotides, which makes it a promising tool to detect extremely low frequency genetic alterations and thus will be very useful in studying disease heterogenicity. By virtue of the unique sequencing adapter&#39;s ligation, this method enables an efficient recovery of ctDNA molecules, while at the same time correcting for errors bidirectionally (sense and antisense). Our selection of 1021 kb probes enriches the measurement of target regions that cover over 95% of the tumor-related driver mutations in 12 tumors. This cost-effective and universal method enables a uniquely successful accumulation of genetic data. After efficiently filtering out background error, ER-seq can precisely detect rare mutations. Using a case study, we present a detailed protocol demonstrating probe design, library construction, and target DNA capture methodologies, while also including the data analysis workflow. The process to carry out this method typically takes 1-2 days.

This manuscript describes a technique for detecting mutations of low frequency in ctDNA, ER-Seq. This method is differentiated by its unique use of two-directional error correction, a special background filter, and efficient molecular acquirement.

Sonraki nesil sıralama kullanarak CtDNA nadir mutasyonların tespiti

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these epigenetic marks is accomplished by sequential oxidation by ten-eleven translocation dioxygenases (TET1-3), followed by the thymine-DNA glycosylase-dependent base excision repair. Inactivation of the TET2 gene due to genetic mutations or by other epigenetic mechanisms is associated with a poor prognosis in patients with diverse cancers, especially hematopoietic malignancies. Here, we describe an efficient single step purification of enzymatically active untagged human TET2 dioxygenase using cation exchange chromatography. We further provide a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) approach that can separate and quantify the four normal DNA bases (A, T, G, and C), as well as the four modified cytosine bases (5-methyl, 5-hydroxymethyl, 5-formyl, and 5-carboxyl). This assay can be used to evaluate the activity of wild type and mutant TET2 dioxygenases.

Here, we present a protocol for an efficient single step purification of the active untagged human ten-eleven translocation-2 (TET2) 5-methylcytosine dioxygenase using ion-exchange chromatography and its assay using a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)-based approach.

Etkili arınma ve on-Eleven Translocation-2 5-metilsitozin Dioxygenase için tahlil LC-MS/MS tabanlı geliştirme

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Biyokimya

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a polymorphic cluster of genes on chromosome 19. Their best-characterized ligands are the human leukocyte antigen (HLA) molecules that are encoded within the major histocompatibility complex (MHC) locus on chromosome 6. There is substantial evidence that they play a significant role in immunity, reproduction, and transplantation, making it crucial to have techniques that can accurately genotype them. However, high-sequence homology, as well as allelic and copy number variation, make it difficult to design methods that can accurately and efficiently genotype all KIR genes. Traditional methods are usually limited in the resolution of data obtained, throughput, cost-effectiveness, and the time taken for setting up and running the experiments. We describe a method called quantitative KIR semi-automated typing (qKAT), which is a high-throughput multiplex real-time polymerase chain reaction method that can determine the gene copy numbers for all genes in the KIR locus. qKAT is a simple high-throughput method that can provide high-resolution KIR copy number data, which can be further used to infer the variations in the structurally polymorphic haplotypes that encompass them. This copy number and haplotype data can be beneficial for studies on large-scale disease associations, population genetics, as well as investigations on expression and functional interactions between KIR and HLA.

Quantitative killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) semi-automated typing (qKAT) is a simple, high-throughput, and cost-effective method to copy number type KIR genes for their application in population and disease association studies.

qKAT: nicel Semi-automated yazmaktan katil hücreli immünglobulin benzeri reseptör gen

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

Saf Hematopoetik kök / progenitör hücrelerin DNA mutasyonları belirlenmesi

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

Kültür Hücreler Kanser ile ilişkili Sinyal İletimi sorgulanması için bir Multiplexed Lusiferaz tabanlı Tarama Platformu

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...