Protokolümüz, in vitro kompartalizasyon ve yönlendirilmiş evrimde benzersiz bir seçim stratejisi kullanarak değiştirilmiş, daha sıkı dizi özellikleri ile restriksiyon enzimlerinin oluşturulmasına olanak sağlar. Herhangi bir kısıtlama enonuklez ve seçim orijinal bir cognate dizisinin daha sıkı sürümü doğru yönlendirilebilir olması gerektiği gibi potansiyel olarak, oldukça evrenseldir. Yeni oluşturulan varyantlar in vitro transkripsiyon-çeviri ile ifade edilirse, protokol yalnızca özgüllüğü daraltmak için değil, aynı zamanda özgüllüğü değiştirmek için de uygundur.
Subsatürasyon mutagenez için sitelere karar vermek için, sitelerin varsayımsal önemine göre mutagenez frekanslarını seçin ve genel kütüphane karmaşıklığını göz önünde bulundurun. Senteze başlamak için, synthesizer içine yeni rezorin ile paketlenmiş sütunlar ekleyin. Oligonükleotidleri üçüzsütuna kadar sentezlemek, ikinci subsatürasyon mutagenez bölgesinden hemen önce üç asal uçtan sayma.
Synthesize, sonunda beş-prime trityl grubu bırakarak. Koruma grubu bir sonraki sentez döngüsünün başında kaldırılacaktır. Reçine toplamak için sentez sütunları açın ve kuru 1,5 mililitre tüpler içine kısaca santrifüj.
CpG sentez desteğini çekin ve girdap ile karıştırın. Karışık CpG recininyeni sentez sütunlarına yeniden bölünmesi. Genel verimi azaltacağı için nemi tanıtmaktan kaçının.
Subsatürasyon mutagenesis site üçlü başlayarak, sentezdevam edin. İstenilen mutagenez frekansına göre rastgele NNS üçüzlerine veya yabani tip üçüzlere sütunatr. Ek subsatürasyon alanları varsa, sadece bir sonraki subsatürasyon mutagenesis bölgesinden önceki üçüz bölgeye ilerleyin.
Akıntının aşağısında başka subsatürasyon alanı yoksa, sentezi tamamlayın ve sonunda beş asal tritil grubu bırakın. 15 mililitrelik konik bir tüpe 225 mikrolitre Span 80 ve 25 mikrolitre Tween 80 ila beş mililitre mineral yağ ekleyerek bir yağ sürfaktan karışımı hazırlamak için geniş delikli pipet ipuçları kullanın. Nazik inversiyon 15 kez iyice karıştırın.
Bu adımda karışım yarı saydam olmalıdır. Her kütüphane için, iki mililitre yuvarlak alt kriyojenik şişe ye yağ sürfaktan karışımı 950 mikrolitre aktarın. Bir kütüphane adı ve buz transferi ile etiket.
Her şişe içine küçük bir silindirik karıştırma çubuğu koyun. Üreticinin önerilerine göre bir in vitro transkripsiyon-çeviri reaksiyon karışımı hazırlayın. 1.5 milimolar son konsantrasyona magnezyum klorür ile karışımı tamamlayın.
Reaksiyon karışımının 50 mikrolitrelik aliquotlarını buz üzerinde 1,5 mililitrelik tüplere dağıtın. Buz üzerindeki reaksiyon karışımına kütüphanenin 1,7 femtomol'lerini ekleyin. İlk 1150 RPM için ayarlanan karıştırma hızı ile manyetik karıştırıcı üzerine buz dolu küçük bir beher yerleştirerek her kütüphane için art arda su-in-oil emülsiyon hazırlayın.
Daha sonra 950 mikrolitre yağ yüzey aktif karışımı ve küçük bir karıştırma çubuğu içeren kriyojenik bir şişeyi manyetik karıştırıcıdaki buz gibi bir kabına aktarın. Karıştırma çubuğunun döndüğünü kontrol edin. 30 saniye aralıklarla iki dakikalık bir süre içinde in vitro kütüphane transkripsiyon-çeviri karışımı beş 10 mikrolitre aliquots ekleyin ve ek bir dakika karıştırmaya devam edin.
Emülsiyon ile şişeyi bir buz kabına aktarın. Bu noktada, sıvı opak değil, yarı saydam olmalıdır. Daha sonra bir sonraki kütüphaneye devam edin.
Tüm kütüphaneler işlendikten sonra, kit üreticisinin önerilerine göre tüm kütüphanelerin kuluçkaya yatmasını başlatın. En az 10 dakika buz üzerine yerleştirmeden önce ek bir iki saat için tasarlanmış enonukleaz için optimum sıcaklık şişeleri aktarın. Kriyojenik şişelerden emülsiyonları 1,5 mililitrelik tüplere aktarın.
5 molar EDTA bir mikrolitre ekleyin. Ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 13,000 kez g santrifüj. Santrifüjden sonra su yağı arayüzünü net bir şekilde göremiyorsanız, üst yağ fazının aspirasyonundan önce karışımı dondurun.
Bir pipet ile üst yağ fazını hareket ettirin ve atın. Hemen sulu faza fenol kloroform 150 mikrolitre ve 100 mikrolitre 10 milimolar Tris-HCl ekleyerek ekstraksiyon gerçekleştirin. Girdap ve daha sonra 13, 000 kez g 30 saniyelik santrifüj ile faz ayırma gerçekleştirmek.
Üst sulu faz toplayın. Üç molar sodyum asetat 15 mikrolitre, glikojen 2,5 ila beş mikrogram ve etanol 375 mikrolitre ekleyerek DNA çökelti. Numuneleri eksi-20 derecede bir saat kuluçkaya yattıktan sonra 13, 000 kat g, 4 santigrat derecede 15 dakika santrifüj.
Supernatant atın ve kısaca soğuk bir mililitre ile pelet yıkayın 70%etanol. DNA glikojen peletini bir hız vac veya hava kurutucusunda beş dakikadan daha uzun süre kurutun. Sonra 10 milimolar Tris-HCl 50 mikrolitre pelet eritin.
Sonra, üreticinin talimatlarına göre hazırlanan streptavidin manyetik boncuklar, beş mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında bir saat, tercihen bir atlıkarınca mikseri veya nazik girdap ile karıştırın. Boncukları ayırmak için tüpleri manyetik bir standa aktarın.
Sonra biotin olmadan DNA ile zenginleştirilmiş sıvı toplamak. Bu protokol, inaktif enzimleri ve ensonükleazları değişmemiş yabani tip dizi özgüllüğü ile tüketerek mühendislik kondisyon ensonükleazlarının istenilen varyantlarının sıklığını artırmak için bir araçtır. Başarılı tarama, gelecek vaat eden varyantların %20'sine kadarını belirleyebilir.
Varyantlar, yabani tip enzimden farklı bir dekolte deseni üretirlerse umut verici varyantlar olarak etiketlenirler. Sıra tercihini değiştirmiş olabilecek türevleri de etiketlenir. Burada gösterilen varyans inaktif çoğunluğu ve görünüşte değişmemiş dekolte deseni ile bir varyant ı ile başarısız bir tarama.
Bu durumda, kütüphaneler büyük olasılıkla streptavidin yakalama seçim adımı kaçtı inaktif varyantları hakimdir. Seçilen ve karşı seçilen dizileri dikkatle tasarlamak ve yalnızca birkaç seçili pozisyonda ikame oluşturan mutagenez stratejisi ile kütüphane çeşitliliğini sınırlamak çok önemlidir. Seçilen en iyi varyantlar, ilk taramanın sonuçlarına göre tercih edilen ve ayrılmayan dizilerde bağlayıcı ve dekolte kinetik leri için iyice karakterize edilmelidir.
Test olgumuzda homoloji modeline göre mutagenez bölgeleri seçilmiştir. Şaşırtıcı bir şekilde, bir kristal yapısı daha sonra bazı değiştirilmiş kalıntılar büyük olasılıkla DNA ile doğrudan temas olmadığını gösterdi.
