Mobil elementler insan genetik istikrarsızlığının en önemli kaynaklarından biridir. Farklı doku ve koşullarda ifadelerini anlamak genom üzerindeki etkilerini anlamak için çok önemlidir. L1 transkriptlerinin büyük kısmı, L1 yaşam döngüsünde hiçbir rolü olmayan diğer transkriptlere L1 ile ilgili dizilerin pasif olarak eklenmesinin sonucudur.
Yaklaşımımız bu alakasız arka planı ortadan kaldırıyor. Bu protokol herhangi bir mobil element, hatta herhangi bir dizi genom virüslerin çalışmalara adapte edilebilir. Loci arasında ayrımcılığa izin vermek için en azından bazı dizi varyasyonları olması gerekir.
Bu yöntemin görsel gösterimi, çekirgeye özgü düzeyde ifade edilen L1 yinelenen öğeleri güvenle tanımlamak için gereken sıkılık ve bakımı göstermek açısından önemlidir. Bu yordamı metin protokolünde açıklandığı gibi sitoplazmik RNA ekstraksiyonu ve yeni nesil sıralama ile başlatın. Sitoplazmik RNA seçilerek, çekirdeğe konan intronik mRNA içinde bulunan L1 ile ilgili okumalar önemli ölçüde tükenir.
Sıralama kitaplığı hazırlanmasında L1'lerle ilgisi olmayan transkripsiyonel gürültüyü azaltmak için atılan bir başka adım da poliainkar edilmiş transkriptlerin seçimini içerir. Bu, mRNA olmayan türlerde bulunan L1 ile ilgili transkript gürültüsünü ortadan kaldırır. Linux terminalinde komut satırı yazarak bowtie1 kullanarak rna seq örnek ilgi FASTQ dosyaları sıralama hizalama paradigması çalıştırın.
Bu hizalama stratejisi transkriptlerin benzersiz ve kapsamlı bir genomik arama ile uyumlu olmasını gerektirir. Bu strateji, özellikle tek bir L1 locus için okuma haritalama arama güven sağlar. Strand çıkış BAM dosyalarını üst iplikçik ve alt iplikçik için seçmek için SAMtools ve Linux komutlarını kullanarak ayırır.
Standart yeni nesil sıralama protokolleri kullanmıyorsa, gerçek bayrak değerlerinin değişebileceğini unutmayın. Bu ipliksi ayırma adımı, l1 retrotranspozisyonuile ilgisi olmayan L1 dizileri içinde oluşan transkripsiyonel gürültüyü, olası antisense L1 ile ilgili eşlenmiş okumaları ortadan kaldırarak filtrelemek için çalışır. Bedtools kullanarak L1 loci için ek açıklamalar karşı okuma sayıları oluşturun.
Önce üst iplikteki duyu yönünde L1'ler için okuma sayıları oluşturmak için komut satırını yazın ve ardından alt iplikteki duyu yönünde L1'ler için okuma sayısı oluşturmak için komut satırını yazın. L1'leri tanımlamak için kullanılan ek açıklamalar, aksi takdirde kesilmiş L1'lerden kaynaklanan arka plan gürültüsünü ortadan kaldırmak için çalışan işlevsel organizatör bölgeleri olan tam uzunluktaki L1'leri gösterir.
Oluşturulan okuma sayısının üzerine kopyalayın ve alt iplikçik için oluşturulan metin dosyasını minus_bottom olarak etiketleyin. Tüm sütunları, j.copy sütununda bulunan en yüksek ve en düşük okuma sayısına göre sıralayın, üst iplikçik için oluşturulan okuma sayıları metin dosyasının üzerinde. J sütununda bulunan en yüksek ve en düşük okuma sayısına göre tüm sütunları sıralayın ve sayfayı top_plus olarak etiketleyin.
Birleştirilmiş olarak etiketlenmiş üçüncü bir sayfa oluşturun ve minus_bottom ve plus_top sayfalarından 10 veya daha fazla okuma içeren tüm loci'yi ekleyin. Tüm sütunları sütunda bulunan en yüksek ten en düşük sayıdana göre sıralayın J.To özellikle L1 loci içinde veya yakınında genomik bölgelerin eşlenebilirliğine yardımcı olun, ilgi türlerinin tüm genom eşleşmi ve sıralanan dosyaları NCBI'den indirildi ve metin protokolünde açıklandığı şekilde FASTQ dosyalarına dönüştürüldü. Şimdi, bam dosyalarını, dosyaları yüklemeden önce IGV olarak kısaltılmış Bütünleştirici Genomik Görüntüleyici'de görüntülenebilir hale getirmek için dizine dizin.
IGV'de açıklamalı genleri görselleştirmek için referans genomu yükleyin. Ayrıca l1 ek açıklama görselleştirmek için tam uzunlukta L1 elemanları için ek açıklama dosyası yükleyin, insan RNA ifade için BAM dosyası, ilgi örneğinden eşlenmiş transkript görselleştirmek ve genomik bölgelerin eşlenebilirliğini değerlendirmek için insan genom ubeskomi için BAM dosyası. Her BAM dosyasıyla ilişkili kapsama alanını ve bağlantı satırlarını kaldırın.
İnsan RNA ifadesi ve insan genom eşlenebilirliği için BAM dosyalarını sıkıştırın, böylece tüm IGV parçaları tek bir ekrana sığar. L1 retrotranspozisyonu ile ilgisi olmayan L1 dizilerinin transkripsiyonel gürültüsünü ortadan kaldırmada son kritik adım, RNA'nın transkriptlerini eşleştirdiği belirlenen tam uzunlukta L1'lerin manuel olarak oluşturulmasıdır. Manuel kürasyon, ifadenin L1 organizatöründen kaynaklandığını doğrulamak için her ifade edilen L1 l1 l1 lokusu çevreleyen genomik ortam bağlamında görselleştirmeyi içerir.
Elektronik tablo kombine sayfasında listelenen L1 loci koordinatlarını kullanarak, IGV'deki çevresindeki genomik ortamlarını inceleyerek her L1 l1 lokusu benzersiz eşlenmiş transkriptlerle el ile düzenlemeyi. L1 yönünde beş kilobaza kadar yukarı doğru okuma yoksa, bir çekirgeyi kendi içinde ifade etmek üzere bir çekirge düzenle. Satırı yeşil renkli olarak etiketle ve neden özgün olarak ifade edilmiş bir L1 olduğunu not edin. L1'in yukarı daki bölgesi eşlenebilir değilse, bu kuralın bir istisnası vardır.
Bu durumda, satırı kırmızı renkle etiketle ve L1 organizatörünün yukarı daki bölgenin ifadesinin değerlendirilemeyeceğini ve bu nedenle L1 ifadesinin güvenle belirlenemeyeceğini unutmayın. Beş kilobases kadar yukarı okur varsa, kendi organizatörü kapalı otantik ifade edilmemesi için bir locus küratörlük. Satırı kırmızı renkle etiketle ve neden özgün olarak ifade edilmiş bir L1 olmadığını not edin. Bir lokus, aynı yönde ifade edilmiş bir genin intronu içinde ifade edilirse, L1'in yukarısında, l1'in yukarısındaki okumalarla aynı yönde ifade edilmiş bir genin aşağı ya da L1'in yukarısındaki okumalarla unannotated ifade desenleri için bir l1'in yukarısı ile ifade edilmiş bir genin yukarısında ise yanlış olarak sıralayın. Bu kuralın bir istisnadoğrudan L1 organizatörü başlangıç sitesi örtüşen en az okuma olduğunda, ancak L1 biraz yukarı sında geçerlidir. Böyle bir L1 örneğinin yukarı sında başka okuma yoksa, bu L1'in özgün olarak ifade edilmesi gerektiğini düşünün.
Satırı yeşil olarak etiketle ve neden özgün olarak ifade edilmiş bir L1 olduğunu not edin. Haritalanmış lokasyondaki okuma ların şekli, belirli L1'in eşlenebilirlik bölgeleriyle ilişkili değilse, bir L1 l1 lokusun sahte olması muhtemeldir. Bir L1 son derece eşlenebilir, ancak sadece L1 içinde yoğunlaşmış bir bölgede okuma yığını varsa, daha az kendi organizatörü kapalı L1 ifade ile ilgili olması muhtemeldir ve exons veya LTR gibi unannotated kaynaklardan olması daha olasıdır. Bu gibi durumlarda, loci turuncu olarak küratörlük ve locus şüpheli neden dikkat edin.
UCSC Genom Tarayıcısı'ndaki L1 konumunu kontrol ederek şüpheli yığın-up kaynaklarını doğrulayın. Bir lokus, düzensiz olarak ifade edilmiş unannotated bölgelerin genomik ortamında gerçek olarak ifade edilmemek için küratörlük. Okumalar L1'in yukarısında 10 kilobaz ifade edilebilir. Ama her 10 kilobases ya da öylesini, orada haritalanmış okur ve bu okumaların bazıları L1 ile hizalamak vardır. Bu L1'lerin genomik ifadenin unannotated desenleri nedeniyle okuma eşlenmiş olması muhtemeldir.
Bu gibi durumlarda, loci kırmızı olarak küratörlük ve locus şüpheli neden dikkat edin. Her L1 loci eşlenebilirlik yardımcı olmak için bedtools programı, FL-L1 ek açıklama ve hizalanmış genomik dizi verileri kullanarak L1 loci benzersiz eşlenen okuma sayısını belirlemek. 400 benzersiz okuma hizalandığında tam kapsama alanı eşlemeli olması için bir L1 locus belirleyin.
Genomik DNA hizalı ölçeklendirmek veya küçültmek için gereken faktörü belirlemek 400 her bir L1 için okur. Bireysel L1 locus eşlenebilirlik göre ifade ölçekli bir ölçü olması için, bireysel otantik ifade L1s hizalamak RNA transkript sayısı ile faktör çarp. Her adım, kendi organizatörü kapalı ifade L1 elemanları arasındaki farkları vurgulamak için kullanılır ve L1 öğeleri L1 yaşam döngüsü ile ilgisi olmayan diğer transkriptler dahil edilebilir tüm yolları. Burada gösterilen transkript du145 prostat tümörü hücre hattında ifade insan genomundaki tüm tam uzunlukta bozulmamış L1s benzersiz bir harita okur.
Siyah, manuel kürden sonra gerçek olarak ifade edilen özel loci'dir. Ve kırmızı belirli loci manuel kürasyon sonra otantik ifade olarak reddedildi vardır. Gri içinde en az 10 okuma her haritalama ile loci vardır.
Bu loci transkript okur küçük bir kısmını temsil gibi, onlar el ile küratörlük değildi. Yaklaşık 4500 loci grafik olarak gösterilmez, çünkü sıfır eşlenen okumalar vardı. Manuel kürlemeden sonra, du145'te özgün olarak ifade edilen belirli L1 loci'ye özgü olarak 175 okumadan rasgele seçilmiş 10 okumadan oluşan en az kesime kadar olan haritanın sayısı okunur.
Okumalar her locus'taki eşleme puanları için ayarlandıktan sonra, çoğu loci için ifade niceliği artırıldı. DU145'te eşlenebilirlik düzeltmeleri ile özgün olarak ifade edilen belirli L1 loci'nin eşlenen okuma sayısı 612 ile dört okuma arasında değişmekteydi ve en yüksekten en düşük ifade loci'ye yeniden sıralandı. Her adım transkripsiyonel arka plan gürültüsü nün yüksek düzeyde azaltılmasında önemli bir rol oynar.
Ancak, en kritik adım kendi organizatörü transkripsiyon onaylamak için her L1 locus manuel kür. DU145 hücrelerinde biyoinformatik olarak tanımlanan L1 locilerinin yaklaşık %50'si, güvenilir sonuçlar elde etmek için gereken katılığı vurgulayarak, diğer transkripsiyonel kaynaklardan kaynaklanan L1 arka plan gürültüsü olarak reddedilmiştir. L1s en genç belirlemek için, biz l1 transkript ve pacbio gibi daha uzun okuma yararlanmak ve daha benzersiz haritalama izin veren sıralama teknolojisi beş başbakan RACE seçimi kullanmanızı öneririz.
Bu yaklaşımla, L1 ifade desenlerini sıkı ve güvenle belirleyebilir ve ölçebiliriz. Bu, bireysel L1 loci'nin düzenlenmesini ve potansiyel etkiyi daha iyi anlamanın yolunu açıyor.
