Bu çalışmada kullanılan insan tümör örnekleri deidentified ve insan araştırma için yerel etik kurallar doğrultusunda ticari kaynaklardan elde edildi.
1. örnek, ekipman ve reaktif hazırlık
<ol><li>
FFPE numune hazırlama
	<ol>
<li>Doku<ol>
<li>Hemen ardından diseksiyon, % 10 tarafsız tamponlanmış formalin (NBF) 16-32 h, oda sıcaklığında (RT) içinde (kalınlığı 3-4 mm bloklar halinde kesilmiş) doku düzeltmek. Not: Fiksasyon zaman doku türü ve boyutu bağlı olarak değişir.</li>
			<li>Örnek 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x ile yıkayın ve bir standart etanol (alkol) serisi kullanarak kurutmak (% 70 alkol 30-60 dk, % 80'i için alkol 30-60 dk, %90 30-60 dk, % 95 alkol alkol 30-60 dk, 3 x %100 alkol için 30-60 dk) ksilen tarafından takip.</li>
			<li>Örnek standart prosedürler6 kullanarak parafin katıştırmak ve aşırı parafin kaldırmak için gerektiği gibi parafin blok döşeme. Not: Blok boyutu doku örnek boyutu bağlı olarak değişir, ancak 0,75 x 0,75 inç2 ya da daha küçük tipik bir boyutudur.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Hücre hatları<ol>
<li>Toplamak ve hücreleri belirli hücre için önerilen yöntem göre cips.</li>
			<li>RT, % 10 formaldehit 24 h için hücrelerde bir rotator düzeltmek.</li>
			<li>Prewarmed işleme jel bir Pelet olarak hücreleri hazırlayın (Örn., Histogel). Buz üstünde jel-hücre Pelet parafilm bir parça üzerine yerleştirerek katılaşmaya Pelet izin ve 2-3 dk. Submerge 1 x PBS jel-hücre Pelet oturmak izin.</li>
			<li>Kurutmak ve 1.1.1. adımda açıklandığı gibi hücre topakları embed.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bölümüne hazırlık<ol>
<li>Katıştırılmış doku/hücre bir microtome kullanarak 5 ± 1 mikron bölümler halinde kesmek, bölümler elektrostatik yapışkanlı cam slaytlarda dağ ve onları gecede RT. kuruması Not: Slaytlar RT 3 aya kadar kuruma altında depolanabilir.</li>
			<li>Slaytları bir slayt rafa yerleştirin ve tahlil yapmadan önce bağlı doku slaytlar 1 h için 60 ° C'de dolaşan bir hava fırında pişirin. Not: slayt hemen kullanın veya stok onları RT Nem Çekiciler ile 1 hafta kadar. Uzun süreli depolama RNA düşmesine neden olabilir.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ekipman hazırlık
	<ol>
<li>Hibridizasyon fırın 40 ° C'ye ayarla İyice ıslak nemlendirici kağıt ve herhangi bir kalıntı dH2O. Ekle kağıt nem kontrol tepsisine çıkarın ve kullanmadan önce en az 30 dk prewarm için hibridizasyon fırın tepsiyi takın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reaktif hazırlık
	<ol>
<li>İki ajan yemekleri 200 mL ksilen ile takas doldurun ve boyama tabağı % 100 200 mL ile doldurulması bölümleri deparaffinization için kullanılan alkol.</li>
		<li>Piyasada bulunan 1 x hedef alma reaktif 200 mL 20 mL 10 x hedef alma reaktif dH2O 180 mL ekleyerek hazırlayın. İki slayt sahipleri bir gemi içinde yeri. Bir slayt sahibi 200 mL 1 x hedef alma reaktif ile doldurun ve diğer slayt tutucu dH2O. ısı 200 mL ile her iki çözüm de gemi kullanarak kaynatın doldurun.</li>
		<li>10-20 dk. hazırlamak 3 L 60 mL sulandrarak tarafından 1 x yıkama arabelleği için 40 ° C sıcak 50 x yıkama arabelleğe dH2O. 2.94 L ile 50 x yıkama tampon prewarmed</li>
		<li>DH2O. için 100 mL 100 mL Gill'in hematoksilen ekleyerek çözüm counterstaining % 50 Gill'in hematoksilen bir duman başlık, hazırlık DH2O. için 250 mL 1,43 mL % 28-30 amonyum hidroksit ekleyerek mavileştirme reaktif (%0.02 (w/v) Amonyaklı su) duman başlık, hazırlık</li>
		<li>10 dk önce sonda hibridizasyon 40 ° C'de hedef sonda prewarm ve RT için kuvvetli reaktifleri (AMP 0-6) getirmek</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. RNA In Situ hibridizasyon tahlil
<ol><li>
Deparaffinization ve su kaybı
	<ol>
<li>1.1.3.2. adımda açıklandığı gibi pişirme sonra (isteğe bağlı durdurma nokta 1), ksilen ajitasyon ile 5 min için bölümlerde deparaffinize. Tekrar 5 dk. Dehydrate % 100 taze ksilen içinde deparaffinize alkol ajitasyon ve tekrar tekrar içinde taze %100 ile 2 min için alkol 2 dk için.</li>
		<li>Hava dolaşan hava fırında 60 ° C'de 5 min için slaytlar kuru veya tamamen onlar kadar RT (isteğe bağlı durdurma noktası 2) kuru.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Örnek pretreatments
	<ol>
<li>~ 4 damla ile bölümlerini kullanıma hazır hidrojen peroksit endojen peroksidaz aktivitesi gidermek için RT, 10 min için kuluçkaya. Slaytları çözümden dikkatle boşaltmak ve iki kez dH2ile O. yıka</li>
		<li>200 mL bölümlerle hedef alma reaktif için 15-30 dakika içinde bir gemi 100 ° C'de kuluçkaya. Not: Kuluçka zaman doku türüne bağlı olarak değişebilir. Bu protokol için hedef alma 15dk tümör örnekleri ve hücre topakları yapıldı.</li>
		<li>Slaytları çözümden dikkatle boşaltmak, durulama iki kez dH2ile O, % 100 daldırma alkol 3 dk ve slaytlar dolaşan hava fırında 60 ° C veya RT kadar tamamen kuru kuru için.</li>
		<li>Hidrofobik bir bariyer hidrofobik bir kalemi yaklaşık 0,75 x 0,75 inç2bölüm çizmek. Not: Bu daha küçük bir engel çizmek için önerilmez. Daha büyük bölümler için büyük bir engel çizilmiş olması gerekir.</li>
		<li>1 dk. tamamen kuru veya gece RT bırakın engeli izin (isteğe bağlı durdurma noktası 3).</li>
		<li>Slaytları bir slayt sahibi yerleştirin ve slayt tutucu nem kontrol tepsisine yerleştirin. Proteaz III ~ 4 damla her slayta eklemek ve onları protein sindirimi için hibridizasyon fırında 40 ° C'de 15-30 dakika için kuluçkaya. Not: Kuluçka süresi doku türüne bağlı olarak değişebilir. Bu protokol için tümör örnekleri için 30 dk ve hücre Pelet 15 dk proteaz sindirim yapıldı.</li>
		<li>Slaytları çözümden dikkatle boşaltmak ve iki kez dH2ile O. yıka</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sonda hibridizasyon
	<ol>
<li>Bölümün tamamını kapsayacak şekilde uygun kullanıma hazır sonda çözüm ~ 4 damla ekleyin. Daha büyük bölümler kullanıyorsanız, Ekle ~ 5-6 damla.</li>
		<li>Hibridizasyon fırında 40 ° C'de 2 h için probları melezlemek. Slaytları çözümden dikkatle boşaltmak ve slaytları 200 mL 1 x yıkama arabellek RT, 2 dk ara sıra ajitasyon ile yıkayın. Bu adımda çamaşır yordamı yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sinyal Güçlendirme
	<ol>
<li>AMP slayt 30 dk. Decant çözüm için hibridizasyon fırında 40 ° C'de 0 ~ 4 damla ile bölümlerini kuluçkaya ve slaytları 200 mL 1 x yıkama arabelleği için RT, 2 dk ara sıra ajitasyon ile yıkayın. Bu adımda çamaşır yordamı yineleyin.</li>
		<li>15 dk. Decant çözüm için hibridizasyon fırında 40 ° C'de slayt AMP 1 ~ 4 damla bölümlerle kuluçkaya ve slaytları 200 mL 1 x yıkama arabellek RT, 2 dk ara sıra ajitasyon ile yıkayın. Çamaşır yordamı yineleyin.</li>
		<li>30 dk. Decant çözüm için hibridizasyon fırında 40 ° C'de slayt AMP 2 ~ 4 damla bölümlerle kuluçkaya ve slaytları 200 mL 1 x yıkama arabellek RT, 2 dk ara sıra ajitasyon ile yıkayın. Çamaşır yordamı yineleyin.</li>
		<li>30 dk. Decant çözüm için hibridizasyon fırında 40 ° C'de slayt AMP 3 ~ 4 damla bölümlerle kuluçkaya ve slaytları 200 mL 1 x yıkama arabellek RT, 2 dk ara sıra ajitasyon ile yıkayın. Çamaşır yordamı yineleyin.</li>
		<li>15 dk. Decant çözüm için hibridizasyon fırında 40 ° C'de slayt AMP 4 ~ 4 damla bölümlerle kuluçkaya ve slaytları 200 mL 1 x yıkama arabellek RT, 2 dk ara sıra ajitasyon ile yıkayın. Çamaşır yordamı yineleyin.</li>
		<li>30 dk. Decant çözüm için RT, slayt AMP 5 ~ 4 damla bölümlerle kuluçkaya ve slaytları 200 mL 1 x yıkama arabellek RT, 2 dk ara sıra ajitasyon ile yıkayın. Çamaşır yordamı yineleyin.</li>
		<li>15 dk. Decant çözüm için RT, slayt AMP 6 ~ 4 damla bölümlerle kuluçkaya ve slaytları 200 mL 1 x yıkama arabellek RT, 2 dk ara sıra ajitasyon ile yıkayın. Çamaşır yordamı yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sinyal algılama
	<ol>
<li>Çözüm çalışma hızlı kırmızı boya hazırlamak. 0,75 x 0,75 inç2 bariyer ile bir slayt için hızlı kırmızı B boya 2 μL hızlı 120 μL için eklemek kırmızı-A içine bir tüp ve karıştırmak iyi. Not: hızlı kırmızı çalışma çözüm hacimleri hidrofobik bariyer ve slayt sayısını boyutuna bağlı olarak değişir.</li>
		<li>Aşırı sıvı slaytlardan dikkatle boşaltmak ve çözüm için slaytları çalışma hızlı kırmızı boya ekleyin. RT, 10 dk içinde belgili tanımlık tepsi ışığa maruz önlemek için bir kapak ile slaytlarını kuluçkaya. Not: hızlı çözüm hazırlık 5 dk içinde çalışma kırmızı kullanın ve doğrudan güneş ışığı veya UV ışığı göstermez.</li>
		<li>Hızlı kırmızı çözüm dikkatle boşaltmak ve slaytlar iki kez dokunun su ile durulayın. Slaytları bir slayt rafa geri yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Counterstaining
	<ol>
<li>Dik Yıkama 2 min için % 50 Gill'in hematoksilen çözüm ile doku bölümleri musluk suyu ile slaytlar counterstain ve slaytların bölümleri mor kalırken, berraklaşana kadar bunu birkaç kez tekrarlayın. Slaytlar mavileştirme için %0,02 amonyak suya daldırma (2-3 kez daldırma). Amonyaklı su musluk suyu ile değiştirin ve slayt 3 – 5 kez yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montaj slayt
	<ol>
<li>Kuru slaytlar dolaşan hava fırında 15 dakika 60 ° C veya RT kadar tamamen kuru. 1-2 damla montaj reaktif her slayt ve yer coverslips her bölümünün üzerine yerleştirin. Hava kabarcıkları herhangi bir bindirme kaçının. Hava kuru en az 5 min için slaytlar. Not: Hızlı kırmızı substrat alkol duyarlı. Alkol slaytları kurutmak değil.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Görselleştirme
	<ol>
<li>Standart aydınlık alan mikroskop altında slaytlar gözlemlemek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bolha, L., Ravnik-Glava&#269;, M., Glava&#269;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs:+Biogenesis,+Function,+and+a+Role+as+Possible+Cancer+Biomarkers.">Circular RNAs: Biogenesis, Function, and a Role as Possible Cancer Biomarkers.</a> International Journal of Genomics. 2017, 6218353 (2017).</li><li>Yamada, A., Yu, P., Lin, W., Okugawa, Y., Boland, C. R., Goel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RNA-Sequencing+approach+for+the+identification+of+novel+long+non-coding+RNA+biomarkers+in+colorectal+cancer.">A RNA-Sequencing approach for the identification of novel long non-coding RNA biomarkers in colorectal cancer.</a> Scientific Reports. 8 (1), 575 (2018).</li><li>Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Ultrasensitive+In+Situ+Hybridization+Approach+to+Detect+Short+Sequences+and+Splice+Variants+with+Cellular+Resolution.">A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution.</a> Molecular Neurobiology. , (2017).</li><li>Mahmood, R., Mason, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-situ+hybridization+of+radioactive+riboprobes+to+RNA+in+tissue+sections.">In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 675-686 (2008).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Paraffin processing of tissue. Protocols Online Available from: <a target="_blank" href="https://www.protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/">https://www.protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/</a> (2016)</li><li>An, Z., Aksoy, O., Zheng, T., Fan, Q. W., Weiss, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+and+EGFRvIII+in+glioblastoma:+signaling+pathways+and+targeted+therapies.">Epidermal growth factor receptor and EGFRvIII in glioblastoma: signaling pathways and targeted therapies.</a> Oncogene. , (2018).</li><li>Frampton, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+MET+via+diverse+exon+14+splicing+alterations+occurs+in+multiple+tumor+types+and+confers+clinical+sensitivity+to+MET+inhibitors.">Activation of MET via diverse exon 14 splicing alterations occurs in multiple tumor types and confers clinical sensitivity to MET inhibitors.</a> Cancer Discovery. 5 (8), 850-859 (2015).</li><li>Awad, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MET+Exon+14+Mutations+in+Non-Small-Cell+Lung+Cancer+Are+Associated+With+Advanced+Age+and+Stage-Dependent+MET+Genomic+Amplification+and+c-Met+Overexpression.">MET Exon 14 Mutations in Non-Small-Cell Lung Cancer Are Associated With Advanced Age and Stage-Dependent MET Genomic Amplification and c-Met Overexpression.</a> Journal of Clinical Oncology. 34 (7), 721-730 (2016).</li><li>Hammond, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Society+of+Clinical+Oncology/College+of+American+Pathologists+guideline+recommendations+for+immunohistochemical+testing+of+estrogen+and+progesterone+receptors+in+breast+cancer.">American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer.</a> Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 134 (6), 907-922 (2010).</li><li>Gan, H. K., Cvrljevic, A. N., Johns, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermal+growth+factor+receptor+variant+III+(EGFRvIII):+where+wild+things+are+altered.">The epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII): where wild things are altered.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 280 (21), 5350-5370 (2013).</li><li>Wheeler, S. E., Egloff, A. M., Wang, L., James, C. D., Hammerman, P. S., Grandis, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+EGFRvIII+detection+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">Challenges in EGFRvIII detection in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Public Library of Science One. 10 (2), e0117781 (2015).</li><li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Junction-specific+and+Quantifiable+In+Situ+Detection+of+AR-V7+and+its+Clinical+Correlates+in+Metastatic+Castration-resistant+Prostate+Cancer.">Novel Junction-specific and Quantifiable In Situ Detection of AR-V7 and its Clinical Correlates in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer.</a> European Urology. , (2017).</li><li>Piwecka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+a+mammalian+circular+RNA+locus+causes+miRNA+deregulation+and+affects+brain+function.">Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function.</a> Science. , (2017).</li><li>Rev&#234;chon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+progerin-expressing+preadipocytes+and+adipocytes+contribute+to+tissue+depletion+over+time.">Rare progerin-expressing preadipocytes and adipocytes contribute to tissue depletion over time.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4405 (2017).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+ectopic+neuritogenesis+by+retinal+rod+bipolar+cells+is+regulated+by+miR-125b-5p+during+retinal+remodeling+in+RCS+rats.">Functional ectopic neuritogenesis by retinal rod bipolar cells is regulated by miR-125b-5p during retinal remodeling in RCS rats.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1011 (2017).</li><li>Yates, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclonal+diversification+of+primary+breast+cancer+revealed+by+multiregion+sequencing.">Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing.</a> Nature Medicine. 21 (7), 751-759 (2015).</li><li>Baker, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+RNA-based+in+situ+mutation+detection+delineates+colorectal+cancer+subclonal+evolution.">Robust RNA-based in situ mutation detection delineates colorectal cancer subclonal evolution.</a> Nature Communications. 8 (1), 1998 (2017).</li></ol>

Tüm yazarlar Gelişmiş hücre tanılama, Inc tarafından istihdam edilmektedir

Bu raporda, roman ISH tahlil Protokolü ve uygulamaları ayrıntılı olarak tartışılmıştır. Tahlil exon kavşaklar, kısa-hedef ve son derece homolog dizileri ve doku bağlamda nokta mutasyonlar doğrudan görselleştirme sağlar. Tahlil RNAscope teknoloji5 üzerinde temel alır ve bu nedenle tek molekül algılama yeteneğine sahiptir. Ancak, bir Gelişmiş amplifikasyon sistemi nedeniyle sinyal bir çift-Z çifti içeren probları ile ya da sadece 50 nukleotid hedef şablon uzunluğu ile tespit edilebilir. Sondalar gibi tek bir çift-Z uzunluğu kısa olduğu için bu exon kavşaklar, kısa-hedef ve son derece homolog dizileri ve nokta mutasyonlar (Tablo 1) tespiti için sağlar.
Testin başarılı performans için çeşitli teknik öneriler vardır. İlk olarak, dokuların taze % 10 tarafsız tamponlanmış formalin içinde (NBF) 16-32 h10için oda sıcaklığında sabit olmalıdır. Underfixation (< 16 h) veya overfixation (> 32 h) tahlil performansını bozabilir ve ek optimizasyon gerektirebilir. İkinci olarak, sıcaklık ve nem, sağlam sonda hibridizasyon ve sinyal güçlendirme için gerekli olan en iyi kontrolünü sağlamak için sistem ve hibridizasyon fırın işleme slayt Protokolü adımları 2.3-5 (proteaz tedavi öncesi, soruşturma için kullanılmalıdır hibridizasyon, sinyal güçlendirme ve sinyali algılama). Üçüncü olarak, aşırı kalan arabellekleri düzgün çıkarmak her adım protokol boyunca önce (ama değil o kadar doku bölümleri kurumasına) olmalıdır. Slaytları kurumasına Eğer önemli non-spesifik sinyal gelişecektir. Dördüncü olarak, doku türüne bağlı olarak, tedavi öncesi optimizasyon gerekli olabilir. Yanlış proteaz kullanarak veya bir suboptimal uzun süre performans altında - veya aşırı - digestion içinde ve sinyal olumsuz etkiler. Son olarak, her zaman pozitif ve negatif kontrolleri ile test probları çalıştırmanız önemlidir. Negatif kontrol probları arka plan çekmiyor ve tahlil doğru yapılması olumlu denetim probları sağlamak ve RNA kalite örnek test sonda sonuçları yorumlama için en uygun olduğundan emin olun. Pozitif kontrol sonda ile sinyal yok RNA kalite örnek sonra suboptimal ve varsa a sinyali test sonda ile görülebilir değil.
El ile testin yanı sıra yetenek otomatik stainers tahlil yapmak da gösterilmiştir (Şekil 6) oldu. Bu otomatik ISH tahlil sinyal / gürültü oranı yüksek verimleri ve Tablo 1' de gösterildiği gibi aynı uygulamalar için geçerlidir; Ancak, otomatik bir tahlil faydaları tahlil koşulları, arası Kullanıcı değişkenliği ve uygulamalı zaman pykał standardizasyonu eklemek ve doku örnekleri yüksek üretilen iş tarama için güvenilir bir şekilde ödeneği.
İmmünhistokimya (IHC) ve qRT-PCR splice türevleri (özellikle EGFRvIII), FFPE klinik örneklerin algılanması için izin verirken bu teknikler gerekli özgüllük eksikliği ve splice Uzaysal Çözünürlük içgörü sunuyor musunuz değişken ifadesi, sırasıyla11,12. Bu iletişim kuralı tahlil önemli bir avantajı morfolojik doku bağlam koruma sırasında onun son derece hassas ve belirli görsel olarak splice kavşak var. Burada, tam olarak EGFRvIII ve METΔ14, dahil olmak üzere çeşitli splice türevleri için benzersiz exon kavşak hedeflemek için tahlil'ın yeteneği gösterilmiştir (Şekil 3 ve 6) oldu. Ayrıca, prostat kanseri, beyin ErbB4, birden çok izoformlarının ve dairesel RNA Cdr1as fare beyin3,13,14nakavt onay splice değişken AR-V7 algılamak için tahlil gösterilmiştir.
Kısa hedef sıra tespit bu ISH tahlil tarafından görselleştirme gibi içinde uzunluk, 50 nukleotid kısa RNA dizilerinin CDR3 dizileri (Şekil 3) Jurkat hücrelerden türetilmiş tespiti tarafından gösterildiği gibi sağlar. Tahlil da Revêchon ve arktarafından gösterildiği gibi diğer aile üyeleri ya da türler, son derece homolog gen dizileri algılayabilir., kim kısa hedef tahlil fare beyaz deri altı yağ dokusu15dakika içinde ifade insan progerin algılamak için kullanılır. Buna ek olarak, küçük genelde RNA (snoRNA), CRISPR-aracılı gen düzenleme ve öncü-mikroRNA kısa hedef tahlil ile tespit edilen in situ olabilir. Daha yakın zamanlarda, Fu ve ark. IHC pre-miRNA mir125b16ifade retina kesin hücreleri tanımlamak için bu ISH tahlil birlikte.
Tümörler profil oluşturma mutasyon tümörler ilerleme çalışmak için ve hedefli tedaviler geliştirmek için önemlidir. Mutasyon profil oluşturma yolu ile yüksek-den geçerek sıralama elde edilebilir olsa da, bu teknoloji tamamen intratumoral heterojenlik veya bağlantı genetik değişiklik ile hücresel morfoloji17,18adresi olamaz. Nokta mutasyonlar bu ISH tahlil kullanarak tespiti çözünürlükte bir tek-base, hücre hatları (Şekil 5) EGFR L858R ve KRAS G12A tek nükleotid değişimler tespiti tarafından doğrulanmış RNA hedef sıralarının düzeye çıkarılmasını sağlar. Ayrıca, Baker ve ark. nokta mutasyon tahlil kolorektal kanser18BRAF, KRAS ve PIK3CA oncogenes birden çok mutasyonların hedeflemek için kullanılır. Onlar tanımlamak ve dağınık şekilde nadir mutant subclones sonuçta nasıl katkıda bulundukları Intra-tümör heterojenite için gösterilen tümör hücrelerinin eşlemek başardık.
Özet olarak, özel bir RNA ISH tahlil geliştirilmiştir. Bu metodoloji splice türevleri, kısa dizileri ve mutasyonlar in situtespiti için sağlar. Performans tarafından el ile gerçekleştirilebilecek yöntemler ve otomatik stainers üzerinde hassas, belirli, ölçülebilir ve adapte olduğunu.

Microarrays ve yeni nesil RNA sıralama (RNAseq) gibi yüksek üretilen iş transcriptomic teknolojileri katlanarak RNA biyolojik dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar için klinik değerle tanı, prognostik ve akıllı keşfi düzeldi kanser1,2. Bu biyolojik hassas tıpta kullanımı ilerlemek için bir yüksek olan RNA biyolojik doku içeriği klinik örneklerin içinde-ebilmek ölçü standart ve sağlam teknolojileri ihtiyacını. Yaygın olarak eziyet ve bağlama deneyleri RNAseq ve kantitatif RT-PCR gibi son derece hassas gen ifade ölçümleri etkinleştirmek kurulmuş olsa da, gerekli doku homojenizasyon ve RNA izolasyon içinde vivo hücre tipi özgüllük kaybı anlamına ve morfolojik bilgileri3. Geleneksel in situ RNA algılama yöntemleri duyarlılık ve özgüllük nadir veya düşük ifade RNA biyolojik doku bağlam4içinde güvenilir bir şekilde ölçmek için gerekli yoksun.
Bir ticari in situ hibridizasyon (ISH) tahlil (Örn., RNAscope tahlil) Bunlar ele vardır bir teknoloji meydan okuyor ve ayrıca tek RNA molekülleri 300'den büyük ve son derece hassas ve belirli görselleştirme sağlar nükleotit doku morfolojik içeriği içinde. Bu tür bir tahlil yaklaşık 6 – 20 çift-Z sonda çiftleri bir Gelişmiş hibridizasyon tabanlı sinyal güçlendirme5ile kombine bir benzersiz oligonükleotid sonda tasarım kullanır.
Bu çalışmada BaseScope, RNA hedef sıraları gibi tek nükleotid çözünürlükte 50 nukleotid kısa algılayabilir önceden tasarlanmış ticari teknoloji için tamamlayıcı bir özel RNA ISH tahlil açıklar. Bu tahlil transcriptome karmaşık karmaşıklığı giderir ve exon kavşaklar, kısa hedef dizileri ve nokta mutasyonlar bir çift-Z sonda çiftini kullanarak doku bağlamda (Tablo 1) doğru tespiti için geçerlidir. FFPE tek nükleotid mutasyonların hücre satırları ve tümör doku ve tam tahlil Protokolü ve kullanımı splice türevleri, T-hücre reseptör klonlar, CDR3 dizileri tespiti ile bu rapor gösterilmiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1692">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">HybEZ Oven (110 or 220 VAC) or HybEZ II Oven (110 or 220V)</td>
			<td style="width:255px;">ACD</td>
			<td style="width:172px;">310010 or 310013 (HybEZ&#8482;), 321710 or 321720 (HybEZ&#8482; II)</td>
			<td style="width:571px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">HybEZ Humidity Control Tray (with lid)</td>
			<td style="width:255px;">ACD</td>
			<td style="width:172px;">310012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">ACD EZ-Batch Slide Rack (20 slide capacity) 1 rack 310017</td>
			<td style="width:255px;">ACD</td>
			<td style="width:172px;">310017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">HybEZ Humidifying Paper</td>
			<td style="width:255px;">ACD</td>
			<td style="width:172px;">310015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen (required)&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Vector Laboratory&#160;</td>
			<td style="width:172px;">H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">SuperFrost Plus Slides (required)&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:172px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">10% neutral-buffered formalin (NBF)&#160;</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Paraffin wax</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Microtome</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:695px;">Gill&#8217;s Hematoxylin I&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">&#160;HXGHE1LT</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Xylene&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">X3P-1GAL</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Tissue-Tek Vertical 24 Slide Rack&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">LWSRA24</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Tissue-Tek Staining Dishes&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">LWT4457EA</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Tissue-Tek Clearing Agent Dishes, xylene resistant&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">LWT4456EA</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:695px;">100% alcohol (EtOH)&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">ALREACS</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">VectaMount Permanent Mounting Medium (required)</td>
			<td style="width:255px;">Vector Labs&#160;</td>
			<td style="width:172px;">H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Cover Glass, 24 x 50 mm</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific/MLS&#160;</td>
			<td style="width:172px;">12-545-F</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Ammonium hydroxide, 28&#8211;30%</td>
			<td style="width:255px;">Sigma-Aldrich/MLS</td>
			<td style="width:172px;">320145-500mL</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Carboy (&#62;3L)</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Oster Steamer Model 5712, Black and Decker Steamer HS3000, or the Braun Multiquick FS 20 Steamer</td>
			<td style="width:255px;">/</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Digital thermometer</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Water bath or incubator, capable of holding temperature at 40 +/&#8211; 1&#176;C</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Pipettors and tips, 1&#8211;1000 &#956;L</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Distilled water</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Tubes (various sizes)</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Fume hood</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Graduated cylinder</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Parafilm</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Paper towel or absorbent paper</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Microscope and accessories</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Drying oven, capable of holding temperature at 60 +/&#8211; 1&#176;C</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Histogel</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">22-110-678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Reagent Kit - RED</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">322900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-EGFR-E1E2</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-EGFR-E1E8</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-EGFR-E7E8</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-EGFR-E8E9</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-MET-E14E15</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-MET-E13E15</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaseScope Hs-KRAS-G12A</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>705491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WT</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>705531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaseScope Hs-EGFR-L858R</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>705451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaseScope Hs-EGFR-L858WT</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>705461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Control Probe Pack Human</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">322975</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing genetic variants, short targets, and point mutations in the morphological tissue context with an rna in situ hybridization assay

Hassas tıp biyolojik doğru tespiti son derece bağımlı olduğundan, RNA biyolojik in situ klinik örneklerin ölçmek standart ve sağlam teknolojileri için artan bir ihtiyaç vardır. Kantitatif RT-PCR etkinleştirmek son derece hassas gen ifade ölçümleri ve eziyet ve bağlama deneyleri RNAseq gibi iken, onlar da RNA ayıklama gerektirir ve böylece değerli ifade analizi morfolojik doku çerçevede önlemek. Burada açıklanan in situ hibridizasyon (ISH) tahlil RNA hedef sıraları gibi 50 nukleotid tek nükleotid çözünürlük ve tek hücre düzeyinde kısa algılayabilir. Bu tahlil daha önce gelişmiş ticari tahlil için tamamlayıcı ve hassas ve belirli in situ tespiti splice türevleri, kısa hedefleri ve nokta mutasyonlar doku içinde sağlar. Bu protokol için probları iki klinik olarak önemli ek yeri değişik, EGFRvIII ve METΔ14 için benzersiz exon kavşak hedeflemek için dizayn edilmiştir. Kısa hedef sıralarının algılama CDR3 dizileri T-hücre reseptör α ve β Jurkat T-hücre doğrultusunda özel algılama tarafından sunuldu. Ayrıca gösterilen bu ISH tahlil için aralarındaki tek nükleotid çözünürlükte (nokta mutasyonlar) aracılığıyla otomatik boyama kullanarak hücre satırları EGFR L858R ve KRAS G12A tek nükleotid değişimler görselleştirme RNA hedef sıralarının yardımcı programıdır platformlar. Özetle, protokol splice türevleri, kısa dizileri ve mutasyonlar in situ el ile performans ve otomatik stainers tespiti sağlar özel bir RNA ISH tahlil gösterir.

Situ hibridizasyon tahlil iş akışı: İş akışını Şekil 1 ' de tasvir ve dört bölümden oluşur: permeabilization hücreleri veya hedef alma ve proteaz çözümleri, RNA, hedefe probları hibridizasyon kurcalayarak sinyal güçlendirme ve görselleştirme sinyal. Dijital görüntüleme yazılım sistemleri kullanarak sinyali de sayısal veya hücre başına nokta sayısını temel alan yarı nicel bir şekilde. Şekil 2 ' de açıklanan elle yapılan prosedür de kadar tamamen ticari otomatik boyama sistemlerinde otomatik.
Temsilcisi exon junction algılama (EGFRvIII splice varyant) boyama: EGFRvIII için yapısal etkin oncogenic7 sinyal önde gelen bir ekzonlar 2 ile 7, çerçeve genomik silme doğar epidermal büyüme faktörü reseptörü bir türevi olduğunu . Tahlil EGFRvIII durum FFPE glioblastoma (GBM) tümör örneklerinde tanımlamak için kullanıldı. Tek Kişilik-Z probları ya WT algılamak için exon kavşak yayılmak üzere tasarlanmıştır mutant veya her iki transkript (Şekil 3A). EGFRvIII özgü probları ekzonlar 1 ve 8 (E1/E8) Kavşağı span ederken WT EGFR probları ekzonlar 1 ve 2 (E1/E2) veya ekzonlar 7 ve 8 (E7/E8), kavşak span. Ekzonlar 8 ve 9 (E8/E9) Kavşağı kapsayan bir ortak araştırma Ayrıca toplam EGFR (WT ve EGFRvIII transkript) tespit etmek için kullanıldı. Tüm Probe prob sonra FFPE GBM örneklerinde EGFR durumunu belirlemek için kullanılmıştır. Şekil 3B ' gösterilen iki temsilcisi örnek daha büyük bir çalışma alınmıştır. EGFR durum bağımsız bir yöntem tarafından RT-PCR doğrulandı. Her iki WT probları her iki örnekleri gösteren iki örnek WT EGFR (3B rakam) hızlı, sinyal algılandı. Ancak, mutant sonda sadece sinyal algılama Bu örnek (Şekil 3B, sol kapı aynası) EGFRvIII değişken için gerçekten olumlu olduğunu teyit EGFRvIII + örnek gösterdi. Diğer taraftan, mutant sonda EGFRvIII-örnek (Şekil 3B, doğru kapı aynası) sinyal algılamadı. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar exon junction tahlil GBM FFPE tümör örneklerinde EGFRvIII durumunu belirleyebilir gösterilmektedir.
Temsilci: kısa hedefler için boyama CDR3 veya tamamlayıcı belirleyici bölge 3, T-hücre reseptör son derece değişken bir malıdır. Genellikle, CDR3 sıra oldukça kısa; Örneğin, Jurkat T-hücre satırından CDR3 α ve β sıraları 51 ve 48 nükleotid uzunluğunda, sırasıyla şunlardır (Şekil 4A). Jurkat hücreleri, CDR3 için antianlamlı probları ifade belirli CDR serileri tanımlamak için α ve β Jurkat T-hücre hattında ifade edilir, ek olarak anlamda probları CDR3 için oluşturulan α ve β olarak hizmet için negatif kontrol sondalar. Tüm Probe prob sonra FFPE hazırlanan Jurkat hücreleri tahlil ile test edildi. Sağlam boyama gözlenen her iki CDR3 için anti-anlamda probları ile α ve β Jurkat hücrelerdeki anlamda probları, ancak algılanan küçük hiçbir sinyal (Şekil 4B). Bu sonuçlar kısa hedef tahlil T-hücre reseptör klonlar için son derece değişken ama kısa CDR serileri arasında ayırt yeteneğini göstermek.
Temsilci: nokta mutasyon EGFR L858R boyama Nokta mutasyonu probları tek nükleotid varyasyonları ve küçük eklemelerin veya silmelerin (INDELs) tümör bağlamda algılamak için geliştirilmiştir. Şekil 5A nokta mutasyon EGFR L858R in situ algılanması için yeteneği gösterir (2573T > G). İki problar tasarlanmıştır: bir L858R algılamak için mutasyona uğramış EGFR sırası ve başka EGFR L858 WT sıra algılamak için. Her iki probları iki FFPE hazırlanan hücre hatlarında test edildi: sadece EGFR L858 WT; ifade H2229 ve L858R EGFR mutasyon için Heterozigoz H1975. L858R mutant sonda sadece H1975 hücre kültürünü ama H2229 hücre kültürünü sinyal algılandı. Ancak, WT sonda her iki hücre hatlarında sinyal algılandı. Benzer şekilde, 5B rakam nokta mutasyon KRAS G12A tespiti in situ görüntüler (35 G > C). İki problar KRAS G12A MT ve KRAS G12 WT diziler algılamak için tasarlanmış ve (ki sadece KRAS G12 WT ifade eder) HuT78 hücre kültürünü ve (KRAS G12A mutasyon için Heterozigoz olan) SW116 hücre satırı üzerinde test edilmiştir. KRAS G12 WT sonda sinyal her iki hücre hatlarında tespit ederken KRAS G12A sonda sinyal SW116 hücre hattında sadece algıladı. Birlikte ele alındığında, bu veri içinde tek nükleotid polimorfizmleri hücre ve doku bağlamda hafiye nokta mutasyon tahlil teknik kapasitesini gösterir.
Temsilci: otomatik in situ tahlil için boyama Otomatikleştirilmiş testleri, arası Kullanıcı değişkenliği ve uygulamalı zamanı en aza indirmek ve sürekli tekrarlanabilir sonuçlar üreten örnekleri daha fazla sayıda için daha güvenilir bir şekilde çalışmasına izin. Bu nedenle, otomatik bir sürüm testin geliştirilmiştir. Bu tahlil ile otomatik boyama göstermek için algılama splice varyantın METΔ14 incelenmiştir. Bu varyant exon 14 pre-yapıştırma, bünye harekete geçirmek ve MET reseptör8,9oncogenic dönüşümü için mRNA sırasında atlanır MET gen sonucudur. İki exon junction problar özellikle METΔ14 değişken algılamak için tasarlanmıştır: bir ekzonlar 13 ve 15 (E13/E15) METΔ14 değişken transkript algılamak için kavşak yayılan ve ekzonlar 14 ve 15 (E14/E15) WT tanıştım algılamak için kavşak kapsayan başka bir Transkript (Şekil 6A). Her iki prob sonra 2 FFPE hazırlanan hücre hatlarında test edildi: METΔ14 değişken ifade eder, H596 ve A549, WT bir araya geldi gen ifade eder. Her iki probları dışlayan ifade desenleri, sadece H596 hücreleri ve sadece A549 hücrelerinde (rakamlar 6B ve 6 C) sinyal algılama E14/E15 sonda sinyal algılama E13/E15 sonda ile gösterdi. Son olarak, sonda dapB için arka plan sinyal (rakamlar 6B ve 6 C) gösteren hiçbir sinyal gösterdi. Genel olarak, bu veri belirli algılama otomatik BaseScope tahlil kullanan MET varyant METΔ14 in situ gösterir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig1.jpg"> Resim 1 : Tahlil iş akışı. İş akışı 4 büyük adımlardan oluşur: hücre ve doku, sonda hibridizasyon hedef RNA, permeabilize ön sinyal güçlendirme ve sinyal algılama görselleştirme aydınlık alan veya floresan mikroskop altında tarafından. Tek tek nokta bir dijital görüntü analiz platformu kullanarak sayılabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig2.jpg"> Resim 2 : Resimde el ile tahlil Protokolü'nün. Tüm tahlil 9 h. bu doku Önarıtma öneriler ile ilgili kuluçka süresi için Kullanım Kılavuzu Ek A danışmak için tavsiye edilir böylece kez doku türüne bağlı olarak değişebilir ön içinde tamamlanabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig3.jpg"> Şekil 3 : Exon junction algılama temsilcisi görüntüler. (A)gösterildi burada EGFR WT ve EGFRvIII transkript ve EGFR WT veya EGFRvIII algılamak için kavşak apışıp kalmak çift-Z exon junction probları resmeden bir şematik exon Teşkilatı vardır. (B) exon junction tahlil yanı sıra pozitif bir denetim sonda, POLR2A ve negatif kontrol sonda, dapB (A), listelenen problar kullanarak iki FFPE glioblastoma örnekleri üzerinde gerçekleştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig4.jpg"> Şekil 4 : Kısa hedef temsilcisi görüntüleri sıra algılama. (A)gösterildi burada Jurkat hücrelerdeki CDR3 dizileri vardır. Kanat ortak sırası sırasıdır siyah ve kırmızı sırayla ya CDR3α ya da CDR3β için benzersizdir. Tek Kişilik-Z kısa hedef sıra probları bu dizilere karşı tasarlanmıştır. (B) kısa hedef tahlil Anti-anlamda ya da sonda (A) serilerinde hedefleme kullanarak bir FFPE hücre Pelet olarak hazırlanan Jurkat hücreleri üzerinde gerçekleştirilmiş ve dapB bir negatif kontrol kullanıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig5.jpg"> Şekil 5 : Nokta mutasyon algılama temsilcisi görüntüler. (A) tahlil gerçekleştirilen H2229 hücreleri (EGFR L858 için homozigoz) ve tek çift-Z nokta mutasyon probları EGFR L858 WT sıra veya EGFR L858R hedefleme kullanarak bir FFPE hücre Pelet hazırlanan H1975 hücreleri (Heterozigoz EGFR L858R mutasyon için) mutasyona uğramış sıra. (B) nokta mutasyon tahlil gerçekleştirilen HuT78 hücreleri (KRAS G12A için homozigoz) ve tek çift-Z nokta mutasyon probları KRAS G12 WT sıra hedefleme kullanarak bir FFPE hücre Pelet hazırlanan SW116 hücreleri (Heterozigoz KRAS G12A mutasyon için) veya KRAS G12A dizisi mutasyona uğramış. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig6.jpg"> Şekil 6 : Otomatik exon junction tahlil ile boyama temsilcisi görüntüler. (A)gösterildi burada olduğunu WT bir araya geldi ve METΔ14 transkriptleri ve bir araya geldi WT veya METΔ14 algılamak için kavşak apışıp kalmak tek kişilik-Z exon junction probları resmeden bir şematik exon Teşkilatı. (B) ve (C) otomatik exon junction tahlil H596 hücreleri (METΔ14 ifade) ve (A), listelenen problar kullanarak bir FFPE hücre Pelet olarak hazırlanan (WT bir araya geldi ifade) A549 hücreleri üzerinde negatif kontrol sonda dapB yanı sıra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>EXoN Junction</td>
			<td>Kısa sıra</td>
			<td>Nokta mutasyon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Değişken/izoformu splice</td>
			<td>Dizileri arasında 50 ve 300 nt</td>
			<td>Nokta mutasyon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dairesel RNA (circRNA)</td>
			<td>Son derece homolog dizileri</td>
			<td>Kısa INDEL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gene füzyon</td>
			<td>CDR3 sırası TCR klonlar için</td>
			<td>Gen düzenleme</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gene nakavt (KO)</td>
			<td>Pre-miRNA</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Küçük genelde RNA (snoRNA)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Gen düzenleme</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: uygulamaları situ tahlil. Bu testin uygulamalar için 3 ana kategorisi vardır: exon junction, kısa hedef sıra ve nokta mutasyon. Her sütunda listelenen her kategori için belirli uygulama örnek verilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay at JoVE.com

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Burada, hassas ve belirli algılama dizileri gibi tek hücre düzeyinde tek nükleotid çözünürlük ile 50 nukleotid kısa sağlayan bir in situ hibridizasyon tahlil açıklayın. El ile veya otomatik olarak gerçekleştirilebilir, tahlil splice türevleri, kısa dizileri ve mutasyonlar doku çerçevede görselleştirme etkinleştirebilirsiniz.

Genetik varyantların, kısa hedefleri ve nokta mutasyonlar bir RNA In Situ hibridizasyon tahlil ile morfolojik doku bağlamda görüntülenmesi

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust ...

visualizing-genetic-variants-short-targets-point-mutations

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

10.5K Görüntüleme.  Advanced Cell Diagnostics, Inc. Burada, hassas ve belirli algılama dizileri gibi tek hücre düzeyinde tek nükleotid çözünürlük ile 50 nukleotid kısa sağlayan bir in situ hibridizasyon tahlil açıklayın. El ile veya otomatik olarak gerçekleştirilebilir, tahlil splice türevleri, kısa dizileri ve mutasyonlar doku çerçevede görselleştirme etkinleştirebilirsiniz.

Video: Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biyoloji

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Civciv Embriyo Sinir İndüksiyon için Testi

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Görselleştirme RNA Yerelleştirme Xenopus Oosit

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in adulthood 1,2,3. Inactivating mutations in KISS1R identified in patients have been associated with iodiopathic hypogonadotropic hypogonadism (IHH) 1,2 and precocious puberty 4. Functional studies of these mutants are crucial for our understanding of the mechanisms underlying the regulation of reproduction by this receptor as well as those shaping the disease outcomes, which result from abnormal KISS1R signaling and function. However, the highly GC-rich sequence of the KISS1R gene makes it rather difficult to introduce mutations or amplify the gene encoding this receptor by PCR.
Here we describe a method to introduce mutations of interest into this highly GC-rich sequence that has been used successfully to generate over a dozen KISS1R mutants in our laboratory. We have optimized the PCR conditions to facilitate the amplification of a range of KISS1R mutants that include substitutions, deletions or insertions in the KISS1R sequence. The addition of a PCR enhancer solution, as well as of a small percentage of DMSO were especially helpful to improve amplification. This optimized procedure may be useful for other GC-rich templates as well.
The expression vector encoding the KISS1R is been used to characterize signaling and function of this receptor in order to understand how mutations may change KISS1R function and lead to the associated reproductive phenotypes. Accordingly, potential applications of KISS1R mutants generated by site-directed mutagenesis can be illustrated by many studies 1,4,5,6,7,8. As an example, the gain-of-function mutation in the KISS1R (Arg386Pro), which is associated with precocious puberty, has been shown to prolong responsiveness of the receptor to ligand stimulation 4 as well as to alter the rate of degradation of KISS1R 9. Interestingly, our studies indicate that KISS1R is degraded by the proteasome, as opposed to the classic lysosomal degradation described for most G protein-coupled receptors 9. In the example presented here, degradation of the KISS1R is investigated in Human Embryonic Kidney Cells (HEK-293) transiently expressing Myc-tagged KISS1R (MycKISS1R) and treated with proteasome or lysosome inhibitors. Cell lysates are immunoprecipitated using an agarose-conjugated anti-myc antibody followed by western blot analysis. Detection and quantification of MycKISS1R on blots is performed using the LI-COR Odyssey Infrared System. This approach may be useful in the study of the degradation of other proteins of interest as well.

Mutations in the kisspeptin receptor (KISS1R) are associated with reproductive disorders in patients. Here we describe how to introduce mutations of interest in the GC-rich sequence of KISS1R as well as the use of KISS1R constructs to characterize the degradation pathway of the receptor by immunoprecipitation and western blot.

Üreme Bozuklukları ile İnsanlardaki Belirlenen GC-zengin KISS1 Reseptör sırası genetik mutasyonlar Mutagenez ve Analiz

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. Each of these features can be accomplished with in situ hybridization to mRNAs within cells. Here we present a radioactive in situ hybridization method modified from Clayton et al. (1988)1 that has been working successfully in our lab for many years, especially for adult vertebrate brains2-5. The long complementary RNA (cRNA) probes to the target sequence allows for detection of low abundance transcripts6,7. Incorporation of radioactive nucleotides into the cRNA probes allows for further detection sensitivity of low abundance transcripts and quantitative analyses, either by light sensitive x-ray film or emulsion coated over the tissue. These detection methods provide a long-term record of target gene expression. Compared with non-radioactive probe methods, such as DIG-labeling, the radioactive probe hybridization method does not require multiple amplification steps using HRP-antibodies and/or TSA kit to detect low abundance transcripts. Therefore, this method provides a linear relation between signal intensity and targeted mRNA amounts for quantitative analysis. It allows processing 100-200 slides simultaneously. It works well for different developmental stages of embryos. Most developmental studies of gene expression use whole embryos and non-radioactive approaches8,9, in part because embryonic tissue is more fragile than adult tissue, with less cohesion between cells, making it difficult to see boundaries between cell populations with tissue sections. In contrast, our radioactive approach, due to the larger range of sensitivity, is able to obtain higher contrast in resolution of gene expression between tissue regions, making it easier to see boundaries between populations. Using this method, researchers could reveal the possible significance of a newly identified gene, and further predict the function of the gene of interest.

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

This protocol is successfully used to quantitatively detect levels and spatial patterns of mRNA expression in multiple tissue types across vertebrate species. The method can detect low abundance transcripts and allows processing of hundreds of slides simultaneously. We present this protocol using expression profiling of avian embryonic brain formation as an example.

Radyoaktif In situ</emDoku Çeşitli Gen Patterns Saptayan> Hibridizasyon

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

RNA Floresan tarafından Tek hücreli Gen Transkripsiyon Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Floresan ile birlikte Kromozom çoğaltılıyor Zamanlama<em&gt; Yerinde</em&gt; Hibridizasyon

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; Yerinde</emTüm Dağı Embriyolar ve Hücre histolojisi&gt; Hibridizasyon Deniz Elasmobranchs İçin Uyarlanmış

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...