Primer tümörlerin sistemik etkilerinin artık metastatik yayılma sürecinde önemli bir rol oynadığı kabul edilmektedir. Bununla birlikte, deneysel metastaz tahlillerinde bu genellikle gözden kaçar. Bu model, araştırmacılara bu etkiyi değerlendirmenin bir yolunu sunmayı amaçlamaktadır.
Bu protokol, klinik olarak anlamlı olan primer bir tümörün cerrahi olarak çıkarılmasından sonra spontan metastazın değerlendirilmesini içerir. Temel olarak, akciğer metastaz büyümesini gerçek zamanlı olarak izlemek için biyolüminesans görüntülemeden de yararlanır. Bu deneysel düzenek, neoadjuvan ortamda meme kanseri için farmakolojik veya genetik müdahalelerin yanı sıra metastatik süreçteki spesifik sinyal yollarının uygunluğunu değerlendirmek için genişletilebilir.
Başlamak için, hücre kültürü ortamını aspire ederek hücreleri hasat edin ve steril PBS ile yıkayın. Daha sonra, hücreler ayrılana kadar 37 santigrat derecede yaklaşık iki ila üç dakika boyunca iki mililitre% 0.25 Tripsin-EDTA çözeltisi ile inkübe edin ve ardından reaksiyonu söndürmek için sekiz milimetre tam ortamla yıkayın. Süpernatanı aspire ettikten ve hücreleri PBS ile yıkadıktan sonra, hücreleri mililitre başına 6 milyon hücreye seyreltmek için gerekli olan hesaplanan hacimde PBS'deki hücreleri yeniden süspanse edin.
Daha sonra hücre süspansiyonunu 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve enjeksiyona hazır olana kadar buz üzerinde tutun. Anestezi uygulanmış farenin karnındaki tüyleri elektrikli makas kullanarak tıraş edin ve ardından sırtüstü pozisyona getirin. Daha sonra hazırlanan karın bölgesini% 70 etanol ve povidon-iyot çözeltisi kullanarak temizleyin.
Makas kullanarak, karın derisinden dördüncü meme dokusu seviyesinde küçük bir orta hat kesisi yapın, altta yatan peritonu açığa çıkarın, ancak alttaki peritona nüfuz etmeyin. Daha sonra forseps kullanarak cildi peritondan uzak tutun ve steril tuzlu suya batırılmış pamuklu çubuklarla cildi peritondan ayırın, sağ meme yağ pedini ortaya çıkarmak için yanal olarak hareket edin ve sol meme yağ pedini ortaya çıkarmak için sol tarafta tekrarlayın. E0771 hücre süspansiyonunu manuel bir pipet kullanarak yeniden askıya aldıktan sonra, 100 mikrolitreyi yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Daha sonra eşit hacimde bazal membran matris çözeltisi ekleyin ve kabarcık oluşturmamaya dikkat ederek iyice karıştırın. Daha sonra tüpü buz üzerinde tutun. 28 gauge 0.5 mililitre U-100 insülin şırıngasına 100 mikrolitre hücre süspansiyonu çekin ve buz üzerinde tutun.
Forseps kullanarak cildi kaldırın ve sol meme yağ pedini nazikçe tutun ve açığa çıkarın. Daha sonra, meme yağ yastığına 50 mikrolitre hücre süspansiyonu enjekte edin ve şırıngayı çıkarmadan önce üç ila beş saniye bekleyin. Daha sonra cildi forsepsten serbest bırakın, doğal olarak normal konumuna dönmesine izin verin ve cilt zımbalarını uygulayarak cilt kesisini kapatın.
Ortotopik meme tümörü lezyonunun büyümesini izlemek için, haftada üç kez kaliperler kullanarak birincil tümör uzunluğunu ve genişliğini ölçün. Anestezi uygulandıktan sonra, ağrı kontrolü için deri altına 40 mikrolitre meloksikam uygulayın ve ardından fareyi sırtüstü pozisyona getirin. Ardından, gerekirse önceki cerrahi zımbaları çıkarın ve karnı% 70 etanol ve povidon-iyot çözeltisi ile temizleyin.
Makas kullanarak, karın derisinden dördüncü meme dokusu seviyesinde küçük bir orta hat kesisi yapın, altta yatan peritonu açığa çıkarın, ancak alttaki peritona nüfuz etmeyin. Daha sonra makas kullanarak tümöre proksimal ve distal olarak yerleştirilmiş normal meme dokusunu keserek ortotopik tümörü çıkarın. Kontralateral tümör ile prosedürü tekrarlarken tümör dokusunu biyolojik tehlike torbasına atın.
Ardından, bir ila üç zımba kullanarak ameliyat bölgesini kapatın ve fareyi altında sıcak bir ısıtma yastığı bulunan temiz bir kurtarma kafesine aktarın. Hayvanlara retroorbital enjeksiyon kullanarak 100 mikrolitre D-lusiferin solüsyonu enjekte edin, iğneyi gözün medial kantusuna burundan 45 derecelik bir açıyla kemik direnci hissedilene kadar sokarak iğnenin retroorbital venöz sinüs içine yerleştirildiğinden emin olun. Teslimat sırasında herhangi bir sıvının geri akmamasıyla enjeksiyonun başarılı olduğunu onaylayın ve görüntülemeden önce iki dakika bekleyin.
Beklerken, hayvanları biyolüminesan görüntüleyicinin içinde bulunan burun konilerine sırtüstü pozisyonda aktarın. Foton akışını ölçmek için, kare ROI düğmesine tıklayarak ROI aracının açılır menüsünün altından görüntüde gösterilen her hayvan için bir kare ROI oluşturun. Otomatik olarak oluşturulan ROI'yi, fare ile tıklayıp sürükleyerek her bir hayvanın göğüs kafesi üzerinde yeniden konumlandırın.
Ardından yatırım getirisini ölç düğmesini tıklayın. Diyafram görünene kadar makas kullanarak göğüs boşluğunun alt kısmını ortaya çıkarmak için cildi, kas sistemini ve peritonu keserek ksifoid işleminin altında bir orta hat kesisi yapın. Daha sonra, akciğerleri çökertmek için diyaframı delin ve ardından diyaframı kesin.
Sağ ve sol taraftaki göğüs kafesini kesin ve ardından ksifoid sürecini yakalamak için bir hemostat kullanın ve göğüs kafesini yoldan çekerek kalbi ve akciğerleri açığa çıkarın. Ardından, makas kullanarak sağ atriyumu kesin. Daha sonra hayvanı sol ventrikülden 10 mililitre buz gibi soğuk PBS ile perfüze edin ve sağ atriyumdan akan sıvının berraklaştığını ve karaciğerin soluk sarı bir renge döndüğünü doğrulayarak perfüzyonun eksiksizliğini değerlendirin.
Ardından, trakeayı tanımlayın ve trakeaya paralel tutarak üç mililitre% 4 paraformaldehit içeren 22 gauge bir iğne şırıngası yerleştirin. Ardından, akciğerler tamamen şişene kadar çözeltiyi yavaş bir hızda verin. Soluk borusunu nazikçe tutmaya devam edin.
Forsepsin üzerinde makasla kesin ve tüm bağ dokusunu çıkarırken dokuyu dikkatlice kaldırmaya başlayın. Sonra, kalbi akciğerlerden uzaklaştırın. Daha sonra, akciğer dokusunu gece boyunca PBS'de% 4 paraformaldehit içine yerleştirin ve fiksasyon için dört santigrat derecede saklayın.
C57 siyah 6 fareler kullanılarak, önemli akciğer metastazı biyolüminesans sinyali tipik olarak primer tümör rezeksiyonundan yaklaşık iki hafta sonra tespit edilir ve zaman içinde takip edilebilir, ancak lusiferaz raportör tipine ve fare suşuna bağlı olarak bazı varyasyonlar bulunabilir. Bitiş noktasındaki akciğer dokusunun ex vivo biyolüminesans görüntülemesi, diğer tedavilerle karşılaştırmak için çizilebilecek akciğer metastatik yükünün doğru ve hassas bir şekilde ölçülmesini sağlar. Stereoskop altında akciğer nodülü sayımı ve hematoksilen ve eozin histolojik analizleri, kantitasyon çalışmalarını tamamlamak için kullanılabilir.
Meme yağ yastığı enjeksiyonundan sonra iğne çekilmesinin biraz geciktirilmesi, matris çözeltisinin jelleşmesine izin verir, bu da hücre süspansiyonunun sızmasını ve meme dışı tümörlerin gelişmesini önlemenin anahtarıdır. Şimdi bu tekniği, metastatik kaskadın, özellikle de metastatik öncesi nişin gelişimini daha fazla incelemek için çeşitli genetik nakavt ve knockin fare modelleriyle birlikte kullanıyoruz.
