Bu protokol, insan diş epitel hücrelerinin temini için geliştirilmiş bir yöntem göstermektedir. İşlemler sırasında toplanan hücre peletini tanımlamak zordur. Kayıp hücre popülasyonlarını önlemek için süpernatant kullanırken dikkatli olun.
Başlamak için, etkilenen üçüncü azı dişlerinin cerrahi olarak çıkarılması sırasında diş köklerini hasat edin. Hücre izolasyon işlemlerine başlayın veya diş köklerini %3 penisilin-streptomisi ile DPBS'de dört santigrat derecede saklayın. Diş köklerini yıkamak için diş folikülünü cımbızla tutun ve yıkama tüpüne yerleştirin 1.
10 ila 15 kez hafifçe sallayın. Çıkar ve tüp 2'ye yerleştir. Tekrar, 10 ila 15 kez sallayın.
Son olarak, çıkar ve tüp 3'e yerleştirin, sonra sallayın. Üç kez yıkadıktan sonra diş foliküllerini 60 milimetrelik bir kültür yemeğine yerleştirin. Diş kökü pulpalı veya yumuşak bir görünüme sahip olana kadar doku makası ile dokuyu kıyma.
Doku kaybını en aza indirmek için kültür çanağının küçük bir yan bölümünü kullanın. Kollajenaz tip 1 ve proteaz çözeltisinin her birini 15 mililitrelik konik tüpte bir mililitre karıştırın. Kıyılmış dokuyu 15 mililitrelik konik tüpe aktarın, sonra hafifçe sallayın ve 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın.
Tüpe beş mililitre %0,05 trypsin-EDTA ekleyin. Sallayın ve 37 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatır. Keratinosit serum içermeyen orta ve %10 fetal sığır serumu içeren keratinosit ortamı hazırlayın.
Yeni bir 50 mililitre konik tüpe üç mililitre keratinosit ortamı ekleyin. Bu tüpün üzerine 40 mikrometrelik bir süzgeç yerleştirin. Daha sonra, süpernatantı 10 mililitrelik serolojik pipet ile dokuyu içeren tüpten epire edin ve süzgeçten geçirin.
Toplanan süspansiyonu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Tüpü santrifüjle ve üstünü çıkarın. Daha sonra üç mililitre keratinosit serumsuz ortam ekleyin.
Üç dakika daha santrifüjleyin ve üst saltantı çıkarın. Tek hücre popülasyonunu keratinosit serumsuz ortamı kullanarak 60 milimetrelik bir kültür çanağına yerleştirin. 37 santigrat derecede %5 karbondioksit nemli bir atmosferde beş mililitrelik son hacimli kültür yemeğini koruyun.
Epitel morfolojisi olan hücreler, tek hücre popülasyonlarını kaplatmalarından sonraki yedi ila 10 gün içinde ortaya çıktı. Parke taşı şeklindeki epitel hücrelerinin sayısı ortaya çıkış sırasında bir ila 10 arasında değişmektedir ve hücreler zamanla kolonilere genişlemiştir. En önemli adım diş folikülünün küçük parçacıklara karışmasıdır.
Tek hücrelerin folikül dokusundan ayrılmasını arttırır. Mezenkimal hücreler insan diş foliküllerinden izole edilebilir. Kültür ortamı içeren serum mezenkimal hücreleri seçer ve tek hücreli popülasyonlardan epitel büyümesini inhibe eder.
Bu protokol, insan diş epitel hücrelerini temin etme yöntemini sağlar. Dental epitel-mezenkimal etkileşimlerin incelenmesinde diş folikül türevi epitel hücreleri kullanılabilir.
