NAPPA ist eine leistungsstarke Protein-Mikroarray-Plattform, die für die Untersuchung der Proteinaktivität und -funktion in einer unvoreingenommenen Hohen Durchsatz-Manier verwendet werden kann. Die auf NAPPA angezeigten Proteine werden in einem menschlichen Expressionssystem mit menschlichen abgeleiteten Ribosomen und Chaperonen hergestellt, um die Wahrscheinlichkeit natürlicher Faltung und Aktivität zu verbessern. Die Verwendung von NAPPA-Arrays zum Screening von Kinase-Inhibitoren bietet eine neue Plattform für den Test neuer Medikamente und klinisch relevanter Kinase-Mutationen.
Protein-Mikroarrays, die durch die NAPPA-Methodik erzeugt werden, können für viele verschiedene Anwendungen verwendet werden, einschließlich Biomarker-Erkennung, Protein-Protein-Wechselwirkungen, Substrat-Identifikation und Arzneimittelscreening. Führen Sie unterwegs Qualitätskontrollschritte durch. Testen Sie die Qualität Ihrer DNA-Präparation, des DNA-Mikroarrays und des Protein-Mikroarrays.
Wenn in irgendeinem Schritt die Qualität nicht gut ist, fangen Sie einfach von vorne an. Das Verfahren wird Lisa Miller demonstrieren, eine Technikerin in meinem Labor. Um das bakterienwachstum für den hauseigenen Hochdurchsatz Mini-Vorbereitung vorzubereiten, impfen Sie zuerst die Bakterien in der Schneckenplatte in einem 96-Well-Format und lassen Sie sie 16 Stunden wachsen.
Am nächsten Tag füllen Sie jeden Brunnen der tiefen Brunnenplatte mit 1,5 Millilitern tollem Brühemedium, ergänzt mit Antikörper-Ampicillin. Der Antikörper hängt vom Selektionsmarker auf dem Plasmid ab. Dann sterilisieren Sie ein 96-Polies-Gerät mit 80% Ethanol und Flamme.
Verwenden Sie das sterile 96-Pin-Gerät, um Kolonien aus der über Nacht bebrüteten Agarplatte zu pflücken und in die Brunnen der Tiefenbrunnenplatte zu tauchen, um die Kultur zu impfen. Bedecken Sie den Block mit einer gasdurchlässigen Dichtung und brüten Sie 22 bis 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 300 bis 800 Umdrehungen pro Minute auf einem Shaker. Danach, Pellet Kulturen und resuspend die Kulturen nach dem Manuskript.
Lyse Bakterien durch Zugabe von 200 Mikroliter Lösung zwei in jedem Brunnen, versiegeln Sie die Platte mit einer Aluminiumdichtung, und invertieren fünfmal. Inkubieren Sie die Zellen für genau fünf Minuten. Um die Lösung zu neutralisieren, fügen Sie 200 Mikroliter Lösung drei hinzu, versiegeln Sie die Platte mit einer Aluminiumdichtung und invertieren Sie fünfmal.
Dann drehen Sie die Platte bei 3800 G, vier Grad Celsius, für 30 Minuten, um den Lysatüberstand zu löschen. Um anionenaustauschen den Harzplatten zuzubereiten, mischen Sie zunächst die Anionenaustauschschlämme und gießen Sie die Gülle in einen Glastrog. Stapeln Sie Filterplatten auf einer tiefen Brunnenplatte, um als Abfallsammelbehälter zu fungieren.
Dann, mit breit bordweiten P1000-Spitzen, mischen Sie die Gülle und übertragen Sie 450 Mikroliter der Gülle in jeden Brunnen der Filterplatten. Zentrifugieren und entsorgen Sie den Durchfluss. Nun, übertragen Sie die Lysat überlagert Überstand auf den Stapel von Harzplatte und tiefen Brunnen block.
Drehen Sie die gestapelten Platten für fünf Minuten bei 30 mal G mit langsamster Anlaufgeschwindigkeit und entsorgen Sie den Durchfluss. Um die Säule zu waschen, fügen Sie 400 Mikroliter Lösung N3 Waschpuffer zu jedem Brunnen. Übertragen Sie die Harzplatte auf Vakuumkrümmer, um den Waschpuffer zu entfernen.
Wiederholen Sie den Waschschritt dreimal und entfernen Sie dann alle verbleibenden Waschpuffer mit einer kurzen fünfminütigen Drehung bei 30-mal G.To die DNA, legen Sie die Harzplatte auf eine saubere 800 Mikroliter Sammelplatte. Fügen Sie 300 Mikroliter Lösung N5 zu jedem Brunnen hinzu und lassen Sie es bei Raumtemperatur für zehn Minuten sitzen. Dann drehen Sie die gestapelten Platten für fünf Minuten bei 20 mal G mit langsamer Anfahrgeschwindigkeit auf 233 mal G für eine Minute.
Platten vor gebrauchen bei minus 20 Grad Celsius lagern. Legen Sie zunächst die Dias auf ein Gestell und tauchen Sie die Dias in ein Glasreservoir, das die Beschichtungslösung von 2% Aminosilanreagenz in Aceton enthält. Rock die Rutschen für 15 Minuten.
Dann spülen Sie die Dias in Aceton gefolgt von einer letzten Spüle in Wasser. Anschließend trocknen Sie die Schlitten mit Druckluft. Blasen auf sie aus allen Winkeln für etwa drei Minuten, bis alle Wassertröpfchen entfernt wurden.
Bewahren Sie die beschichteten Dias bei Raumtemperatur auf einem Metallträger in einer dicht verschlossenen Box auf. Nun, fahren Sie fort, die DNA, wie in der Handschrift beschrieben, zu stürzen. Dann setzen Sie das DNA-Pellet in 20 Mikroliter Reinstwasser wieder auf und schütteln Sie es zwei Stunden lang bei 1000 Umdrehungen pro Minute.
Um eine Arrayprobe vorzubereiten, fügen Sie jeder DNA-Probe 10 Mikroliter frisch zubereiteter Druckmischung hinzu, die Antikörper, Verklinker und Polylysin enthält. Platten mit Alufolie versiegeln und bei Raumtemperatur 90 Minuten bei 1000 Umdrehungen pro Minute schütteln. Lagern Sie die Teller über Nacht bei vier Grad Celsius.
Am Drucktag kurz wirbeln und drehen Sie die Platten. 28 Mikroliter jeder Probe auf eine 384-Well-Platte übertragen. Legen Sie die aminosilanbeschichteten Dias und die 384-Well-Platte auf das Arrayer-Deck und starten Sie das Microarray-Druckprogramm.
Wenn der Druckvorgang abgeschlossen ist, beschriften Sie die Mikroarrays. Die Mikroarrays können monatelang bis zur weiteren Verwendung gelagert werden. Um die DNA-Werte zu messen, legen Sie die Dias in eine Pipettenbox und blockieren Sie sie mit 50 Millilitern Sperrpuffer.
Inkubieren Sie die Rutschen auf einem Schaukelshaker bei Raumtemperatur für eine Stunde. Entsorgen Sie dann die Lösung und fügen Sie 20 Milliliter Blockierpuffer und 33 Mikroliter fluoreszierenden DNA-Interkalierenden Farbstoff hinzu. 15 Minuten mit Aufregung inkubieren.
Nach der Inkubation ist die Dias schnell mit reinem Reinstwasser abspülen und mit Druckluft trocknen. Die Mikroarrays können gescannt werden. Um die Mikroarrays auszudrücken, blockieren Sie die Dias wie zuvor gezeigt und spülen Sie sie dann mit reinem Ultrawasser ab und trocknen Sie sie mit gefilterter Druckluft.
Befestigen Sie eine Dichtung an jeder Rutsche. Fügen Sie 130 Milliliter In-vitro-Transkription und Übersetzungsmischung auf die Dias und massieren Sie die Dichtungen sanft, so dass sich die In-vitro-Transkriptions- und Translationsmischung ausbreitet und den gesamten Bereich des Arrays ohne Blasen abdeckt. Tragen Sie die kleinen runden Hafendichtungen auf beide Ports auf.
90 Minuten bei 30 Grad Celsius zur Proteinexpression inkubieren, gefolgt von 30 Minuten bei 15 Grad Celsius zur Immobilisierung des Abfrageproteins. Dann entfernen Sie die Dichtung, waschen Sie die Dias dreimal für jeweils fünf Minuten in 15 Milliliter TBST mit Milch, und blockieren Sie in der gleichen Lösung für eine Stunde. Für den Nachweis der Proteine auf dem Array, entfernen Sie die TBST mit Milch, legen Sie die Dias auf eine Gitterplatte, und wenden Sie 600 Mikroliter primärer Antikörper, Maus Anti-Flag, verdünnt ein bis zweihundert, und 1x TBST mit 5% Milch ergänzt.
Eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Dias mit 50 Millilitern 1x TBST und 5% Milch auf dem Schaukelschüttler dreimal für jeweils fünf Minuten. Wiederholen Sie den Vorgang für den sekundären Antikörper.
Nachdem die einstündige Inkubation vorbei ist, waschen Sie die Dias mit 1x TBST dreimal für jeweils fünf Minuten auf den Schaukelschüttler. Dann spülen Sie die Dias schnell mit reinem Reinstwasser ab und trocknen Sie mit Druckluft. Die Dias können gescannt werden.
Um die Phosphatase- und DNase-Behandlung durchzuführen, waschen und blockieren Sie die exprimierten Dias mit TBST, ergänzt mit 3%BSA, wie im Manuskript beschrieben. Dann legen Sie die Dias auf eine Gitterplatte und tragen 200 Mikroliter Phosphatase-DNase-Lösung auf. Legen Sie einen Mikroarray-Abdeckungsschlupf auf die Oberseite, um Verdunstung zu vermeiden.
Bei 30 Grad Celsius für eine Stunde und 30 Minuten im Ofen brüten. Dann rutschen Sie mit 1x TBST und 0,2 Mol Natriumchlorid auf dem Schaukelschüttler dreimal für jeweils fünf Minuten. Um die medikamentöse Behandlung und Kinase-Reaktion durchzuführen, legen Sie die Dias auf die Gitterplatte und wenden Sie 200 Mikroliter Der Wirkstoffkinaselösung auf.
Legen Sie einen Deckelschlupf auf die Oberseite, um Verdunstung zu vermeiden. Eine Stunde bei 30 Grad Celsius im Ofen brüten. Der Schlüssel zu reproduzierbaren Daten ist die konsistente Inkubationszeit über Folien hinweg.
Dies ist besonders wichtig während der Kinase-Reaktion. Die für die Verarbeitung der einzelnen Folien erforderliche Zeit sollte berücksichtigt werden. Danach rutschen Sie dreimal für jeweils fünf Minuten mit 1x TBST und 0,2 Molnatriumchlorid auf den Schaukelschüttler.
Wiederholen Sie den Proteinnachweis unter Verwendung als primärer Antikörper phosphotyrosin Antikörper verdünnt ein bis 100 in TBST, ergänzt mit 3%rinderserum albumin. Verwenden Sie 1x TBST und 3%rinderserumalbumin zum Waschen nach der Inkubation mit primärem Antikörper und TBST für Waschungen nach Inkubationen mit sekundärem Antikörper. Waschen und trocknen wie bisher.
Laden Sie die Mikroarrays zur Bildaufnahme in das Diahaltermagazin. Laden Sie das Magazin in den Microarray-Scanner ein. Scannen Sie alle Mikroarrays mit den optimierten Einstellungen und denken Sie daran, die automatische Verstärkung auszuschalten, wenn Sie Bilder über Experimente hinweg vergleichen.
Übertragen Sie die Bilder in eine Quantifizierungssoftware, richten Sie das Raster an den Spots aus und quantifizieren Sie die Signalintensität jedes Features auf dem Mikroarray. Fahren Sie mit der statistischen Analyse fort. In dieser Studie zeigte das Mikroarray, dass die Mehrheit der Flecken, die komplementäre DNA enthalten, erfolgreich nachweisbare Proteinmengen aufweisen.
NAPPA-Kinase-Mikroarrays zeigten eine gute Reproduzierbarkeit unter Dias, wobei die Korrelation der Proteindarstellungsniveaus unter verschiedenen Druckchargen höher als 0,88 war. Repräsentative Ergebnisse der Kinase-Aktivität in NAPPA-Kinase-Arrays zeigten einen hohen Gehalt an Proteinphosphorylierung nach expression. Der Vergleich zwischen Mikroarrays, bei denen die Phosphorylierungswerte direkt nach der Phosphatase-Behandlung und nach 60 Minuten Autophosphorylierungsreaktion gemessen wurden, deutet auf das Vorhandensein aktiver Proteinkiinasen auf dem Array hin.
Bei NAPPA-Kinase-Arrays zeigte Imatinib eine signifikante Verringerung der ABL1- und BCR-ABL1-Aktivität, während andere Kinasen weitgehend unbeeinflusst blieben. Die Kinase-Aktivität normalisierte sich gegen das dephosphorylierte Array und stellte als Prozentsatz der Positivkontrolle Mikroarray sprägpunktte selektive Hemmung von Imatinib zu ABL1 und BCR-ABL1. Typische Ergebnisse für das Ibrutinib-Screening zeigten, dass die Kinase-Aktivität der Nicht-relevanten Kinase ABL1 nicht beeinflusst ist.
BTK kanonisches Ziel und ERBB4 potenzielles neues Ziel, zeigte reduzierte Aktivität in Gegenwart von Ibrutinib. Die Daten deuten darauf hin, dass ERBB4 durch Ibrutinib dosisspezifisch gehemmt werden kann. Der Erfolg von Protein-Mikroarray-Screenings hängt stark von der Qualität des Mikroarrays selbst ab.
Mehrere positive und negative Kontrollfunktionen sollten verwendet werden, um eine ordnungsgemäße Datenanalyse zu ermöglichen. NAPPA-Kinase-Assay ist eine Screening-Plattform, und als solche sollten die erhaltenen Daten in Follow-up-Assays validiert werden, die In-vitro-Kinase-Assays oder zellbasierte Assays umfassen können. Da unser Protokoll mit cDNA beginnt, kann jede Kinasemutation oder -variation leicht in das Mikroarray integriert und mit hohem Durchsatz untersucht werden.
Bei der Herstellung der Anionenaustauscherharzschlämme und Platten wird die Verwendung von Masken empfohlen, um eine mögliche Einatmung der Harzpartikel zu verhindern.
