O NAPPA é uma poderosa plataforma de microarray proteica que pode ser usada para o estudo da atividade e função proteica de forma imparcial de alto rendimento. As proteínas exibidas no NAPPA são produzidas em um sistema de expressão de base humana usando ribossomos e acompanhantes derivados humanos, a fim de melhorar a probabilidade de dobras naturais e atividade. O uso de matrizes NAPPA para a triagem de inibidores de quinase fornecem uma nova plataforma para o teste de novas drogas e mutações de quinase clinicamente relevantes.
Microarrays proteicas geradas pela metodologia NAPPA podem ser usadas para muitas aplicações distintas, incluindo descoberta de biomarcadores, interações proteína-proteína, identificação de substratos e rastreamento de medicamentos. Execute etapas de controle de qualidade ao longo do caminho. Teste a qualidade da preparação do dna, a microarray de DNA e a microarray proteica.
Se em qualquer passo a qualidade não é boa, é só começar de novo. Demonstrando o procedimento estará Lisa Miller, uma técnica do meu laboratório. Para preparar o crescimento bacteriano para a mini-preparação de alto rendimento da casa, primeiro inocular as bactérias na placa auger em um formato de 96 poços, e deixá-la crescer por 16 horas.
No dia seguinte, encha cada poço da placa de poço profundo com 1,5 mililitros de caldo fantástico médio, complementado com ampicillina anticorpo. O anticorpo depende do marcador de seleção no plasmídeo. Em seguida, esterilize um dispositivo de 96 pinos com 80% de etanol e chama.
Use o dispositivo estéril de 96 pinos para colher colônias da placa de ágar incubada durante a noite e submergir nos poços da placa do poço profundo para inocular a cultura. Cubra o bloco com um selo permeável a gás e incubar em um agitador por 22 a 24 horas a 37 graus Celsius, e 300 a 800 rpm. Depois disso, culturas de pelotas e resuspensam as culturas de acordo com o manuscrito.
Bactérias lyse adicionando 200 microliters de solução dois em cada poço, selar a placa com uma vedação de alumínio, e inverter cinco vezes. Incubar as células por exatamente cinco minutos. Para neutralizar a solução, adicione 200 microliters da solução três, sele a placa com uma vedação de alumínio e inverta cinco vezes.
Em seguida, gire a placa a 3800 G, quatro graus Celsius, por 30 minutos para limpar o supernatante lysate. Para preparar placas de resina de troca de ânion, primeiro, misture o chorume de troca de ânion e despeje o chorume em um cocho de vidro. Empilhe placas de filtro em cima de uma placa de poço profundo para atuar como um vaso de coleta de lixo.
Em seguida, usando pontas P1000 de placa larga, misture o chorume e transfira 450 microliters do chorume para cada poço das placas do filtro. Centrifugar e descartar o fluxo. Agora, transfira os supernantes lysate para a pilha de placa de resina e bloco de poço profundo.
Gire as placas empilhadas por cinco minutos a 30 vezes G com velocidade de rampa mais lenta e descarte o fluxo através. Para lavar a coluna, adicione 400 microliters de solução N3 tampão de lavagem a cada poço. Transfira a placa de resina para aspirar o coletor para remover o tampão de lavagem.
Repita a etapa de lavagem três vezes e, em seguida, remova qualquer tampão de arruela restante com um breve giro de cinco minutos a 30 vezes G.To elute o DNA, coloque a placa de resina em uma placa de coleta limpa de 800 microliter. Adicione 300 microliters de solução N5 a cada poço e deixe-o sentado à temperatura ambiente por dez minutos. Em seguida, gire as placas empilhadas por cinco minutos a 20 vezes G com velocidade de rampa lenta até 233 vezes G por um minuto.
Armazene placas a 20 graus Celsius negativos antes de usar. Primeiro, coloque os slides em um rack e submerse os slides em reservatório de vidro contendo a solução de revestimento de reagente de 2% de aminosilano em acetona. Balance os slides por 15 minutos.
Em seguida, enxágue os slides em acetona seguido de uma lavagem final na água. Em seguida, seque as lâminas usando ar pressionado. Soprando sobre eles de todos os ângulos por cerca de três minutos até que todas as gotículas de água tenham sido removidas.
Armazene os slides revestidos à temperatura ambiente em um rack de metal dentro de uma caixa bem selada. Agora, prossiga para precipitar o DNA como descrito no manuscrito. Em seguida, resuspenque a pelota de DNA em 20 microliters de água ultrapura e agite a 1000 rpm por duas horas.
Para preparar a amostra de matriz, adicione 10 microliters de mistura de impressão recém-preparada que contém o anticorpo, crosslinker e polilise a cada amostra de DNA. Placas de vedação com papel alumínio e trema à temperatura ambiente por 90 minutos a 1000 rpm. Armazene as placas durante a noite a quatro graus Celsius.
No dia da impressão, brevemente vórtice e gire as placas. Transfira 28 microliters de cada amostra para uma placa de 384 poços. Coloque os slides revestidos de aminosilano e a placa 384, no deck do arrayer, e inicie o programa de impressão de microarray.
Quando a impressão estiver pronta, rotule as microarrays. As microarrays podem ser armazenadas por meses até uso posterior. Para medir os níveis de DNA, coloque os slides em uma caixa de pipeta e bloqueie-os com 50 mililitros de tampão de bloqueio.
Incubar os slides em um agitador de balanço à temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, descarte a solução e adicione 20 mililitros de tampão de bloqueio e 33 microliters de corante fluorescente de DNA. Incubar por 15 minutos com agitação.
Após o fim da incubação, enxágue rapidamente os slides com água ultra pura e seco com ar pressionado. As microarrays estão prontas para serem escaneadas. Para expressar as microarrays, bloqueie os slides como mostrado anteriormente e enxágue-os com água ultra pura e seque com ar comprimido filtrado.
Conecte uma junta de vedação a cada slide. Adicione 130 mililitros de transcrição in vitro e misture a tradução nos slides, e massageie suavemente as juntas de vedação para que a transcrição in vitro e a mistura de tradução se espalhem e cubra toda a área da matriz sem bolhas. Aplique as pequenas vedações de porta redonda em ambas as portas.
Incubar por 90 minutos a 30 graus Celsius para expressão proteica, seguido de 30 minutos a 15 graus Celsius para imobilização da proteína de consulta. Em seguida, remova a junta, lave os slides três vezes por cinco minutos cada em 15 mililitros TBST com leite e bloqueie a mesma solução por uma hora. Para a detecção das proteínas na matriz, remova o TBST com leite, coloque os slides em uma placa de grade e aplique 600 microliters de anticorpo primário, anti-bandeira de rato, diluído de um a duzentos, e 1x TBST suplementado com 5% de leite.
Incubar por uma hora em temperatura ambiente. Lave os slides com 50 mililitros de 1x TBST e 5% de leite no shaker de balanço três vezes por cinco minutos cada. Repita o procedimento para o anticorpo secundário.
Após o fim da incubação de uma hora, lave os slides com 1x TBST no shaker de balanço três vezes por cinco minutos cada. Em seguida, enxágue rapidamente os slides com água ultra pura, e seque usando ar pressionado. Os slides estão prontos para serem escaneados.
Para realizar o tratamento fosfatese e DNase, lave e bloqueie os slides expressos com TBST suplementado com 3%BSA como descrito no manuscrito. Em seguida, coloque os slides em uma placa de grade e aplique 200 microliters de solução fosfatese DNase. Coloque um deslizamento de tampa de microarray em cima para evitar a evaporação.
Incubar a 30 graus Celsius durante uma hora e 30 minutos no forno. Em seguida, lave slides com 1x TBST e 0,2 cloreto de sódio molar no shaker de balanço três vezes por cinco minutos cada. Para realizar o tratamento medicamentoso e a reação de quinase, coloque os slides na placa de grade e aplique 200 microliters de solução de quinase medicamentosa.
Coloque um deslizamento de tampa em cima para evitar a evaporação. Incubar por uma hora a 30 graus Celsius no forno. A chave para dados reprodutíveis é o tempo de incubação consistente entre slides.
Isso é especialmente importante durante a reação da quinase. O tempo necessário para processar cada slide deve ser contabilizado. Depois disso, lave slides com 1x TBST e 0,2 cloreto de sódio molar no shaker de balanço três vezes por cinco minutos cada.
Detecção de proteína repetida usando como anticorpo de anticorpos fosfotyrosina primário diluído de um a 100 em TBST, suplementado com albumina de soro bovino de 3%. Use 1x TBST e 3% de albumina de soro bovino para lavagem após a incubação com anticorpo primário, e TBST para lavagens após incubações com anticorpo secundário. Lave e seque como antes.
Para aquisição de imagens, carregue as microarrays na revista porta-slides. Coloque a revista no scanner de microarray. Escaneie todas as microarrays com as configurações otimizadas e lembre-se de desativar o ganho automático ao comparar imagens entre experimentos.
Transfira as imagens para um software de quantificação, alinhe a grade com as manchas e quantifique a intensidade do sinal de cada recurso na microarray. Prossiga com a análise estatística. Neste estudo, a microarray mostrou que a maioria das manchas contendo DNA complementar apresentou com sucesso níveis detectáveis de proteína.
As microarrays nappa quinase apresentaram boa reprodutibilidade entre slides, com a correlação dos níveis de exibição de proteína entre lotes de impressão distintos superiores a 0,88. Os resultados representativos da atividade de quinase nos arrays de quinase NAPPA mostraram altos níveis de fosforilação proteica após a expressão. A comparação entre microarrays em que os níveis de fosforilação foram medidos logo após o tratamento fosfatase, e após 60 minutos de reação de autofosforilação, sugere a presença de quinases de proteína ativa na matriz.
Nas matrizes de quinase NAPPA, o imatinib apresentou uma redução significativa na atividade ABL1 e BCR-ABL1, enquanto outras quinases permaneceram em sua maioria não afetadas. A atividade de quinase normalizou-se em relação à matriz desfosforilada e representou como porcentagem da microarray de controle positivo mostrou inibição seletiva de imatinib em relação ao ABL1 e BCR-ABL1. Os resultados típicos obtidos para a triagem de ibrutinib mostraram que a atividade de quinase da quinase não relevante ABL1 não foi afetada.
O alvo canônico BTK, e o potencial novo alvo erbb4, mostraram atividade reduzida na presença de ibrutinib. Os dados sugerem que o ERBB4 pode ser inibido por ibrutinib de forma específica de dose. O sucesso dos exames de microarraia proteica são altamente dependentes da qualidade da microarray em si.
Vários recursos de controle positivos e negativos devem ser usados para permitir a análise adequada dos dados. O ensaio nappa quinase é uma plataforma de triagem e, como tal, os dados obtidos devem ser validados em ensaios de acompanhamento, que podem incluir ensaios de quinase in vitro ou ensaios baseados em células. Uma vez que nosso protocolo começa com cDNA, qualquer mutação ou variação de quinase pode ser facilmente incorporada na microarray e estudada em alta produtividade.
Durante a preparação da troca de ânions de chorume e placas de resina, recomenda-se o uso de máscaras para evitar possível inalação das partículas de resina.
