Kolezzi esculentasından arındırılmış hidrofilik proteinde tarin 48 kilodalton globüler tuzaklarında, lipozomal nanokapsüllerin ekstrüzyon tekniği ile hazırlanması adım adım yapılacaktır. Nanokapsüllerin karakterizasyonu için tüm prosedürler taramalı elektron mikroskobu ve dinamik ışık saçılımı da takip edilecektir içerir. Capsulation prosedürleri yüksek verimlilik kapsülleme başarı lipidler seçimi bazı zorluklarla karşı karşıya olabilir, tuzak moleküllerin biyo aktivitesi tutarak.
Tanımlanacak protokol bu zorlukların bazılarının üstesinden gelebilir. Analitik bir denge kullanarak lipozom bileşenleri tartın. Malzeme kaybını önlemek için bir döner evaporatör sığar hacimsel bir şişe kullanarak kloroform lipid bileşenleri eritin.
15 dakika boyunca 150 RPM karışımı karıştırın. Bir döner evaporatör kullanarak kloroform çıkarın. Isıtma banyosundan gelen su yla temas halindeyken, en iyi verimlilik için hacimsel şişe ağzını standart konuma ayarlayın.
Parametreleri açıklanan protokole göre ayarlayın. Yaklaşık 25 dakika sonra, şişeyi çıkarın ve buharlaşan çözücüye uygun şekilde atın. İnce ve opak bir film oluşur ve kolayca görselleştirilebilir.
Mililitre başına bir miligram tarin içeren amonyum sülfat çözeltisi lipid film nemlendirin. Karışımı 40 dakika karıştırın ve bir gecede dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Sonra, 25 santigrat derece, oda sıcaklığında bir dakika için süspansiyon sonicate.
Vezikül boyutunu azaltmak ve agregasyonönlemek için, iki önceden ıslak filtre destekler arasında polikarbonat membran yerleştirin ve tutucu içine yerleştirin. Boş bir şırıngayı cihaza takın, diğerini liposomal süspansiyonun bir mililitresiyle doldurun ve karşı tarafa takın. 2 mikrometrelik polikarbonat gözenek membranı ile 12 çevrim ekstrüzyon gerçekleştirin.
Numuneyi bir şırıngadan diğerine yavaşça itin. Sonunda, lipozomal süspansiyon gezi işlemi sırasında net olmalıdır, boyut azaltma sonucu. Bu adımda yaklaşık 2 mililitre numune kaybedilebilir.
Ultracentrifugation ile lipozomları ayırın. İlk olarak, titanyum tüp içine örnek tartmak ve tüpler denge. Doldurulması gereken minimum hacmi kontrol edin ve gerekirse hacmi amonyum sülfat ile ayarlayın.
Titanyum tüpleri salıncak kovasına yerleştirin. Santrifüj kapağını açın ve rotoru içine yerleştirin. Santrifüj kapağını kapatın, vakuma basın ve vakum 200'den 20 mikrondan daha azına ulaşana kadar bekleyin.
Ultracentrifuge ekranındaki parametreleri ayarlayın. Geri çağırmaya basın, koşulları kontrol edin ve koşmaya başlayın. 90 dakika sonra vakum düğmesine tıklayarak vakum bırakın ve santrifüj kapağını açın.
Pervaneyi içinden çıkarın. Buz üzerinde ultracentrifuge örnek koruyun ve sonra pelet supernatant ayırın, tüpü baş aşağı çevirerek, tek kullanımlık 59 mil santrifüj içine pelet supernatant ayırmak için. Kapsülsüz protein içeren süpernatantı dört santigrat derecede saklayın.
Bu kapsülleme verimliliğini belirlemek için kullanılacaktır. Pelet yarı saydam jöle olarak sunulur. Pelet ve ısı HEPES tamponlu tuzlu çözelti askıya alın.
Daha fazla bilgi için lütfen protokolü kontrol edin. Protein nicelemine lipid girişimini önlemek için Peterson'ın protokolü ile kapsülleme verimliliğini belirleyin. Örnekler triplicate olarak analiz edilmelidir.
Bir mikrofuge tüpünde, lipsomal supernatant veya BSA'yı mililitre başına bir mililitrede su ile bir mililitrelik son hacmiseyreltin. DOC ekleyin ve 10 dakika kuluçka. % 72 TCA 1 mililitre ekleyin ve iyice karıştırın.
Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 3, 000 g santrifüj. Tüpü aşağı doğru önleyerek, emici bir kağıda koyarak ve kurumasını sağlayarak süpernatant'ı dikkatlice atın. Bir mililitre suda peleti askıya alın.
Peletin çözünmüş olduğundan emin olmak için iyice karıştırın. Daha sonra, test tüpleri için örnek aktarın. Bir mililitre reaktif A ekleyin, oda sıcaklığında 10 dakika karıştırın ve kuluçkaya yatırın.
5 mililitre reaktif B ekleyin, Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca karıştırın ve inkübasyonu, ışıktan korundu. Emiciliği 750 nanometre olarak belirleyin ve kapsülleme verimliliğini hesaplayın. Boyut ortalaması ve boyut dağılımı dinamik ışık saçılımı ile belirlenir.
Lipozomal nanovezikülleri tek kullanımlık boyutlandırma cuvette'ye aktarın. Cuvette'yi ekipmanın içine sığdırın. Ekipman parametrelerini ayarlayın.
Stabilite tayini için lipozomları dört santigrat derecede saklayın ve boyut dağılımını ve boyut ortalamasını düzenli olarak kontrol edin. Elektron mikroskobu tarayarak lipozom karakterizasyonu, Murta ve Ramasamy'ye göre triplicate olarak yapılır. Bir Petri kabının altındaki cam kapak fişleri bir bant ile düzeltin.
Kapağı Poly-L-lizin ile kaplayın. Bir saat boyunca nem ve kuluçka korumak için Petri çanak içine ıslak bir filtre kağıdı yerleştirin. Distile su ile durulayın.
Örnek bir damla ekleyin ve oda sıcaklığında, bir saat kurumasını bekleyin. Örnekleri düzeltmek için fosfat tamponu içinde hazırlanan glutaraldehit ile kaplayın. Petri kabının içine ıslak filtre kağıtları yerleştirin.
Petri kabını mühürlemek önemlidir. 48 saat boyunca 4 santigrat derecede kuluçkaya yat. Kapağı aynı fosfat tamponuyla beşer dakika boyunca üç kez durulayın.
Örnekleri %35'ten mutlak etanole kadar artan bir etanol konsantrasyonu çözeltisinde yıkayarak aşağıdaki gibi kurutun. Kimyasal 10 dakika hexamethyldisilazane ile örnekleri kuru. Hexamethyldisilazane dikkatle bir duman başlık içinde manipüle edilmelidir.
Numunelerin bir desiccator içinde veya oda sıcaklığında duman kaputunun içinde bir gecede kurumasına izin verilmelidir. Kurutulmuş numuneleri karbon iletken yapışkan bantla bir sapa monte edin. Koçanları altınla fışkırt.
Düşük vakum modunda ve düşük voltajda, 20 kilovolt bir tarama elektron mikroskobu, SEM, ile SEM görüntüleri kaydedin. Şekil bir nano lipozom hazırlık açıklar. Fosfolipidler, uyuşturucu, peg, ve kimyalar, ana lipozom bileşenleri, ilk lipid film elde etmek için kloroform içinde çözüldü.
Lipid film daha sonra bir tuzlu tampon rehydrated oldu, hidrofilik protein içeren, tarin, tuzak olmak, ve kuluçka bir gecede önceden oluşturulmalıdır. Daha sonra, sonication ve ekstrüzyon küçük unilamellar veziküller oluşturmak için uygulanır. Ultracentrifugation adım serbest lipidler lipozomal hazırlık ayırır, ve kapsülsüz protein.
Supernatant tuzak verimliliği nin belirlenmesi için kullanılıriken. Söz konusu metodoloji kullanılarak üretilen nanolipozomlar 51 ila 396 nanometre arasında değişen bir boyut dağılımı ve 155 nanometre ortalama boyutu sergilerler. Polidispersity indeksi 168 olduğundan hazırlık homojendir.
Lipozomlar 2 mikrometre lik gözenek boyutu zarı ile ekstrüzyon edilirse %83'lük yüksek bir tuzak verimliliğine ulaşılır. Morfolojik nanolipozom özellikleri taramalı elektron mikroskobu ile değerlendirildi. Lipozomlar nihayet canlı hücrelere benzer tedavi edilmelidir, daha kaliteli görüntüler elde etmek için.
Fiksasyon ve kurutma prosedürleri vakum koşullarında 20 kilovolt üzerinde destekleyen küçük bozulmamış veziküllerin görüntülenmesi sağlamak için önemlidir. Şekil 2A ve 2B, 20 kilovolt olarak analiz edilen 121 nanometre aralığında yuvarlak şekilli lipozomal vezikülleri gösterir. 2C ve 2D rakamları ise yetersiz hazırlanmış örnekleri görüntüler.
Yanlış tedavi edilen numuneler sadece vakum ve voltaj koşullarına dayanamayan daha büyük veya hasarlı veziküllerin gözlemi için izin verilir. Protokol, burada, yuvarlak bir şekil, küçük yüzey ve yaklaşık 150 nanometre ortalama boyutu gösteren tekrarlanabilir veziküllerin üretimi için izin açıklanmıştır. Bu yöntem, bir tetramerik protein olarak, hidrofilik bir düzeltici sergileyen karmaşık ve büyük molekülleri tuzağa düşürmek için kullanılabilir.
Eksik kendi kendine tuzak% 80 daha yüksek ve sızıntı oranı çok düşük, düşük 1.5% nanokapsüller dört santigrat derecede depolandığında. Bu videonun teri gibi büyük moleküllerin kapsüllanmasında size yardımcı olacağını umuyoruz.
