Bu çalışma Howard Hughes Tıp Enstitüsü (HHMI) Ortak İnovasyon Ödülü ile desteklenmiştir. LAM Sinyali ve Sağlık eğitim bursu Hücresel Yönetmeliği Ulusal Enstitüsü (T32 GM008759) ve NIH Ruth L. Kirschstein Ön Doktora Sonrası (CA165349-01) tarafından desteklenmiştir. Biz onların değerli yorumları için Prof Michael Stowell (CU Boulder), Prof Douglas Rees ve Prof Rob Phillips (Caltech) teşekkür etmek istiyorum.

1. Lipozom preparatı <ol><li> Bir Teflon astarlı kapakla bir 20 ml bir cam şişe al. </li><li> Bulaşmasını önlemek için kullanmadan önce kloroform ile tüm cam ve şırıngalar temizleyin. </li><li> Bir 250 uL hava geçirmez bir cam şırınga kullanılarak bir cam şişeye saflıkta kloroform 100 uL transfer edin. </li><li> Bir 100 uL hava geçirmez bir cam şırınga kullanılarak aynı cam şişeye tepkin madde gradlı metanol 30 uL ekleyin. </li><li> Fosfatidiletanolamin (POPE): a 2 mM 7:1.5:1.5 fosfatidilkolin (POPC) hazırlamak için kolesterol lipid çözeltisi, 11 mg / mL &#39;lik 10 mg / mL Pope ve 20 ul uL 10 mg / mL POPC, 42 ve 216 uL transferi 20 ml bir cam şişeye CHCl3 kolesterol çözümler. </li><li> Lipit ince bir film şişeye altındaki gözlenene kadar yavaş akış argon veya nitrojen gazı ile organik çözücüler buharlaşır. </li><li> Artık çözücü kaldırmak için, en azından 30 dakika boyunca bir vakumlu kurutucuda kapağını açıp cam şişeye yerleştirin. </li><li> Trtamponu ansfer 2 mL, daha önce hidrat lipidler için bir cam şişeye, bir 0.2 mikron filtreden geçirilir. </li><li> 4 ° C de bir gece azından karışımı inkübe ve 48 saat içinde kullanımı. </li></ol> 2. Freeze-ve-çözülme: 30 Lipozom Ölçüler de - 100 nm Sadece <ol><li> 15 saniye boyunca sıvı nitrojen içinde lipozom süspansiyon dondurun. </li><li> 42 bir ısıtma bloğu kullanarak lipozom süspansiyon çözülme ° ~ 3 dakika C sıcaklık. </li><li> 5 döngü toplam adımları 2.1 ve 2.2 tekrarlayın. </li></ol> 3. Ekstrüzyon Doğru kendilerine rehber kitapta enstrüman anahat kullanarak, Liposofast LF-50 ekstruder monte Avestin yönergeleri izleyin. <ol><li> Destek filtre tabanında büyük bir delik destek ekranı (dairesel delik ile) yerleştirin, dairesel sinterlenmiş çanağı (deliksiz), bir dren disk (çapı 25 mm), bir polikarbonat membran (çapı 25 mm) izledi. </li><li> Küçük, siyah koyunDestek filtre tabanına sabitlemek için membran üstündeki O-ring. </li><li> 4 deliklere 4 vidayı sıkarak üst filtre ekstruder takın. </li><li> Büyük ekstruder varil altındaki üzere filtre ekstruder birimi birleştirin. Silindir namluya lipozom çözüm ekleyin. Için ekstrüzyon varil üzerinde aşağıdaki yerleştirin: büyük dairesel O-ring, dar kap, büyük dairesel O-ring, dairesel kap. </li><li> Ekstruder varil başına gaz regülatörü takın ve basınç tahliye vanası dahil olmak üzere hava kaçağı önlemek için tüm vanaları kapatın. Bir 20 ml bir cam şişe ya ekstruder filtre ünitesi altında 50 ml Erlenmeyer şişesinde yerleştirin. Bir emniyet valfi regülatör bağlı ve 600 psi basınç aşarsa yayınlayacak. Azot gazı açın ve ekstruder bağlı gaz vanasını açın. </li><li> Azot basıncı 400 nm lipozomlar, 100 nm lipozomlar için 125 psi ve 30 nm lipozomlar için 400-500 psi 25 psi artırın. </li><li> Lipozom süspansiyon izlemeknitrojen ile itilerek edilirken ension bu kap içine çıkarır gibi. Artık cam şişe içinde ekstruder filtresi aracılığıyla herhangi bir sıvı geçen gözlemlemek kadar azot akan tutun. </li></ol> 4. Dinamik ışık saçılımı (DLS) Analizi <ol><li> Bir 20 uM lipozom solüsyonu 50 uL hazırlayın. </li><li> Güç kaynağı ve lamba kaynağı açın. </li><li> DynaPro yazılımını açın. </li><li> 30 nm ve 100 nm ve&gt; 100 nm lipozomlar tespit MS800 algoritma modeli lipozomlar algılamak için MS / X algoritma modeli için yazılım ayarlayın. </li><li> Donanım bağlanın. </li><li> Hücre tutucusu içine kuvars küvet ve yerleştirmeye lipozom numunesi pipetleyin 14 uL. </li><li> Başlatmak basın. </li><li> 30 satın alma - ~ 20 sonra durması basın. </li><li> Histogram kaydedilen ortalama lipozom çapı zirveleri analiz edin. </li></ol> 5.. Takip nanoparçacık Analizi (NTA) <ol><li> Bir 500 uL, 0.1 uM lipozom hazırlamakçözüm. </li><li> Su ve etanol ile örnek bölmesi çalkalayın. </li><li> Bir tüy bırakmayan kağıt havlu ile örnek bölmesi kurulayın. </li><li> Lazer güç kaynağı ve bilgisayarı açın. </li><li> Örnek bölmesine 0.1 uM lipozom çözüm 300 uL sunun. </li><li> Sıcaklık kontrolü ve Nanopartikül Takip Analiz yazılımı açın. </li><li> Lazer açmak için düğmeye Yakalama basın. </li><li> Sahne taşımak ve mikroskop odağı ayarlamak için yatay ve dikey ayarlamaları kullanın. </li><li> Istenilen sıcaklığa (20 ° C) ve kayıt süresi (en az 30 saniye) ayarlayın. </li><li> Zaman belirli bir miktar için lipozom parçacıkların birden fazla resim çerçeveleri çekmek için Kaydet düğmesine basın. Her parçacığın hareket izler olarak histogram üzerine çapı lipozom boyutları karşılık gelen tepe analiz. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Ekstrüzyon yöntemi özetleyen bir şema, pŞekil 1 &#39;de temsil edilir. , En iyi sonuçlar elde 30 nm çaplı lipozomlar hazırlanması ~ 500 psi ve 100 nm çaplı bir yüksek basınç gerektirir hızlı bir filtre hızı elde etmek için 125 psi&#39;lik bir basınçta gerektirir. 400 nm çaplar için, ~ 25 psi arasında bir alçak basınç kesecikler daha büyük, daha homojen bir lipozom uzamasına ve oluşturmasına izin veren yavaş filtre oranının elde edilmesi tavsiye edilir. Biz tutarlı mikronaltı vezikül boyutları üretmek için optimal basınç belirlemek için bir dizi deney gerçekleştirdi. Biz basıncı gibi ekstrüzyon gözenek 30 ebatlarında, 100 ve 400 nm ile polikarbonat filtrelerden geçer sayısı çeşitlidir ve her istenilen boyutu için uygun basınç keşfetti. 30 nm gözenekler için 500 psi basınç altında uzama ve böylece daha büyük vezikül boyutları neden akış hızı azaltacaktır. 100 nm gözenekler için, sürekli bir akış 125 psi sağlandı. 400 nm gözenekler için, düşük basınçlı (25 psi) veziküller daha büyük vezikül s içine uzamasına izin verirsimgelediği kabul edilir. Yavaş açılan bilge filtrasyon akışı büyük mikronaltı veziküller 13 oluşturmak için en uygunudur. Biz üç farklı çapta, yani 30, 100 ve 400 nm ile ekstrüde lipozom boyutlarını belirlemek için DLS yapıldı. DLS partikül çapı belirlemek için saçılan ışık toplayan oluşturulmuş bir yöntemdir. Filtre gözenek ile 5 pas ve 2 ile 25 psi az 400 nm polikarbonat membran ile 125 psi 100 nm polikarbonat membran, filtre gözenek 5 ile geçer ile 500 psi bir polikarbonat 30 nm zarından 2 mM Biz ekstrüde hidrate lipozomlar Filtre gözenek geçer. 30, 100 ve 400 nm gözenek boyutları için lipozomlar ve DLS ile ölçülen çapları 66 ± 28, 138 ± 18 ve 360 ± 25 nm (Şekil 2). Bu 47 çapı 16 nm ± kaydedildi Şekil 2, gösterildiği gibi, 50 nm polistiren boncuklar bir süspansiyon, bir kalibrasyon, standart olarak kullanıldı. Yüzde polydispersity lipozom boyutları içinde herhangi bir örtüşme olmadığını göstermektedir. Bu cihaz daha büyük parçacıklar 12 doğru var bilinen önyargı nedeniyle DLS analizi kullanırken 30 nm daha yüksek çapları gözlemlemek için tipiktir. Büyük ve küçük parçacıklar ışık saçılımı şiddetlerde süspansiyon 12 lipozomlar çözmek için bir algılama yöntemi aynı anda toplanan ve böylece daha sert edilir. Bu enstrümantal sınırlamaya rağmen, kalibrasyon eğrisi yakın bir doğrusal ilişki açıklanır. NTA parçacık kırılma indisi veya yoğunluk bağımsız bir sıvı ortam, difüzyon doğrudan gözlemler her parçacığın boyutu ölçen yeni bir teknolojidir. Bu, yüksek çözünürlükte tekniği ile DLS lipozomlar ölçümü takviye etmek için kullanılabilir. NTA kalibrasyon için kullanılan 95 çapları ± 48 ve 356 ± 51 nm, iki adet 100 nm ve 400 nm polistiren çözümler kaydetti. 30 nm ve 100 nm Lipid çözümleri daha comp kaldığı görüldü<html> olarak ortalama 29 boyutları ± 14, 95 ± 17 ve 359 ± 73 nm üreten, Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi DLS göre işlenebilir çapı. 1000 nm - NTA duyarlılığını o 50 parçacıkları ölçmek için sağlar yana mikroskobik partikülleri ölçmek için daha genel bir karakterizasyon tekniği olabilir. Kalibrasyon eğrisi kaydedilen NTA çapı karşı polikarbonat membran gözenekleri arasında doğrusal bir ilişki gösterir. <table border="1"><tbody><tr><td> Lipozom Boyutları </td><td> Algılama Eşiği </td><td> Beklenen Minimum Partikül Boyutu (nm) </td></tr><tr><td> 30 nm </td><td> 11 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 100 nm </td><td> 11 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400 nm </td><td> 21 </td><td> 400 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Nanosight Parametreler. ad/4151/4151fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1. Açıklayan ekstrüzyon yöntemi akış şeması, baskının nasıl ve azot akış farklı lipozom çaplarda homojenliği kontrol eder. Lipozom hidrasyonu takiben, farklı boyutlarda tek lamelli kesecikler farklı basınçlarda farklı polikarbonat membran filtreden gözenekler aracılığıyla uzatılır. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig2.jpg" /> Şekil 2. Ekstrüzyon sonrası kantitatif lipozom boyutlarını açıklayan Dinamik ışık saçılımı (DLS) verileri. (A) Bar grafikler üç lipozom örnekleri arasında çapı tarif etmek için gösterilmiştir. 50 nm polistiren (PS) boncuk bir kalibrasyon standart bir referans olarak kullanılmıştır. Ortalama çapı lipozom her bir örnek için çubuğu yukarıda belirtilmiştir. X-ekseni çözümlerle haddelenmiş olduğu üzere gözenek boyutları açıklanmaktadır. Y-ekseni DLS tarafından kaydedilen çapı açıklanmaktadır. Rağmen 30 nm ve 100 nm boyutları rekorbüyük 400 nm boyutu biraz daha düşük bir boyutu kaydedildi ederken ed kendi gözenek boyutları daha yüksek değerleri, kalibrasyon eğrisi (b) x-ekseni polikarbonat membran gözenek boyutları ifade yakın bir lineer korelasyon gösterir ve y-ekseni tarif DLS tarafından lipozom çapı kaydedildi. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig3.jpg" /> Ekstrüzyon takiben lipozom boyutları tarif Şekil 3. Nanopartikül Takip Analizi (NTA) veri. (A), her çubuk grafik lipozom örneğin çapı temsil eder. X-ekseni çözümlerle haddelenmiş olduğu üzere gözenek boyutları açıklanmaktadır. Y-ekseni NTA tarafından kaydedilen çapı açıklanmaktadır. Ortalama çapı lipozom her numune yukarıda etiketlenmiştir. (B) NTA kalibrasyon eğrisi kaydedildi çapına karşılık filtre zarı gözenek boyutları arasındaki DLS kalibrasyon eğrisi daha doğrusal bir ilişki gösterir. X-ekseni polikarbonat membran gözenek boyutları açıklar. Y-ekseni NTA tarafından kaydedilen lipozom çapı açıklanmaktadır. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig4.jpg" /> Şekil 4. Ekstrüzyon ardından her lipozom boyutu (500 uM) gösteren Negatif leke transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüler. Su içinde% 1 uranil asetat öncesinde 34.000 × büyütmede kurutma ve görüntüleme için örnekler leke kullanılan nerede Karbon Formvar örgü ızgaralar olumsuz örnek boyamadan önce taburcu edildi. Boyutları 30, 100 ve 400 nm açık bir şekilde birbirinden farklıdır. Büyütme 25.000 × ayarlandı. Ölçek çubuğu 0,5 mikron temsil eder. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/4151/4151fig5.jpg" /> Şekil 5. Bir zaman elbette deneyi üç lipozom boyutları ile yapılmıştır. Dinamik ışık saçılımı (DLS) her lipozom çözelti hemen aşağıdaki ekstrüzyon için ölçüldü. Bütün lipozom çözümler 4 bekletildi °C de bir gece. Bunların çapları bir gece inkübasyondan sonra DLS tarafından kaydedildi. Hiç değişiklik 16 saat inkübasyon döneminden sonra gözlenmiştir.

<ol>
	<li>Connor, J., Bucana, C., Fidler, I. J., Schroit, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation-dependent+expression+of+phosphatidylserine+in+mammalian+plasma+membranes:+quantitative+assessment+of+outer-leaflet+lipid+by+prothrombinase+complex+formation.">Differentiation-dependent expression of phosphatidylserine in mammalian plasma membranes: quantitative assessment of outer-leaflet lipid by prothrombinase complex formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3184-3188 (1989).</li><li>Smith, S. A., Morrissey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+incorporation+of+tissue+factor+into+liposomes.">Rapid and efficient incorporation of tissue factor into liposomes.</a> J. Thromb. Haemost. 2, 1155-1162 (2004).</li><li>Hui, E., Johnson, C. P., Yao, J., Dunning, F. M., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptotagmin-mediated+bending+of+the+target+membrane+is+a+critical+step+in+Ca(2+)-regulated+fusion.">Synaptotagmin-mediated bending of the target membrane is a critical step in Ca(2+)-regulated fusion.</a> Cell. 138, 709-721 (2009).</li><li>Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedures+for+the+coupling+of+proteins+to+liposomes.">Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes.</a> J. Immunol. Methods. 132, 25-35 (1990).</li><li>Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrusion+technique+to+generate+liposomes+of+defined+size.">Extrusion technique to generate liposomes of defined size.</a> Methods Enzymol. 367, 3-14 (2003).</li><li>Gruner, S. M., Cullis, P. R., Hope, M. J., Tilcock, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+polymorphism:+the+molecular+basis+of+nonbilayer+phases.">Lipid polymorphism: the molecular basis of nonbilayer phases.</a> Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 14, 211-238 (1985).</li><li>Guven, A., Ortiz, M., Constanti, M., O'Sullivan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+method+for+the+size+separation+of+homogeneous+fluorescein-encapsulating+liposomes.">Rapid and efficient method for the size separation of homogeneous fluorescein-encapsulating liposomes.</a> J. Liposome. Res. 19, 148-154 (2009).</li><li>Zimmerberg, J., Kozlov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+produce+cellular+membrane+curvature.">How proteins produce cellular membrane curvature.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 9-19 (2006).</li><li>Chonn, A., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+liposomal+drug-delivery+systems.">Recent advances in liposomal drug-delivery systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 6, 698-708 (1995).</li><li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicles+of+variable+sizes+produced+by+a+rapid+extrusion+procedure.">Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure.</a> Biochim. Biophys. Acta. 858, 161-168 (1986).</li><li>Matsuoka, K., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+liposomes+to+study+COPII-+and+COPI-coated+vesicle+formation+and+membrane+protein+sorting.">The use of liposomes to study COPII- and COPI-coated vesicle formation and membrane protein sorting.</a> Methods. 20, 417-428 (2001).</li><li>Dragovic, R. A., Gardiner, C., Brooks, A. S., Tannetta, D. S., Ferguson, D., Hole, P., Carr, B., Redman, C., Harris, A. L., Dobson, P. J., Harrison, P., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine. , (2011).</li><li>Hunter, D. G., Frisken, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+extrusion+pressure+and+lipid+properties+on+the+size+and+polydispersity+of+lipid+vesicles.">Effect of extrusion pressure and lipid properties on the size and polydispersity of lipid vesicles.</a> Biophys J. 74, 2996-3002 (1998).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Avestin Liposofast LF-50 Extruder kullanarak, ne kadar küçük ölçekli, sentetik lipozomlar bir basınç kontrol sistemi ile hazırlanmıştır gösterdi. Bu multilamellar veziküller küçük nanopartiküllerin üretimine yol açabilir lipozom hidrasyon, sonrasında kendiliğinden oluşması dikkat etmek önemlidir. Bu küçük multilamellar veziküller kaçınılmaz olarak büyük bir filtre gözenek tarafından üretilen ünilamellar veziküllerin çözümleri heterojenite neden büyük polikarbonat membran gözen...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Kloroform </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 02.432-25ml </td><td> % 95 stabilizatörler </td></tr><tr><td> Yüksek Dereceli Metanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 179.337-4L </td><td></td></tr><tr><td> Liposofast LF-50 Extruder </td><td> Avestin, Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfolipidler </td><td> Avanti Polar Lipidler </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Polikarbonat Gözenekler </td><td> Avestin, Inc </td><td></td><td> 25 mm çapında </td></tr><tr><td> Diskler PE boşaltın </td><td> Avestin, Inc </td><td> 230600 </td><td> 25 mm çapında </td></tr></tbody></table>

constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of nano-sized lipid vesicles

Lipozomlar, yaygın olarak protein-protein, protein-lipid etkileşimler 3, monitör ilaç teslim 4,5, ve kapsülleme 4 platformun çalışmak için taklit eden bir hücre membranı olarak kullanılan doğal ve sentetik fosfolipidler oluşan yapay olarak hazırlanmış kesecikler vardır. Fosfolipidler doğal bir misel kendisini ayıran, kavisli lipid bilayers oluşturun. 6 Lipozomlar geleneksel bilayers, yani büyük tek lamelli kesecikler (luvs), küçük tek lamelli kesecikler (SUV) ve multilamellar veziküller (MLVs) 7 büyüklüğü ve sayısına göre sınıflandırılır. Özellikle, çeşitli boyutlarda homojen lipozomlar hazırlanması endo-ve ekzositoz olayları, membran füzyon ve protein trafiğini 8, hücre sinyal hayati bir rol oynar membran eğrilik eğitim için önemlidir. 400 - Birçok grup proteinleri membran eğrilik içerir ve bu nedenle çapları lipozomlar hazırlamak süreçleri &lt;100 modüle kullanılır nasıl analizhücre fonksiyonlarını 3 davranışlarını incelemek için Nm. Diğer araçların ilgi 9 uyuşturucu taşımak ve teslim gibi lipozomlar okuyan, lipozom-ilaç kapsülleme odaklanın. Lipozom oluşumu sırasında 9 bildirildiği gibi, Drug kapsülleme elde edilebilir. Bizim ekstrüzyon adım iki nedenden dolayı kapsüllü ilaç etkilememesi gerektiğini, yani (1) ilaç kapsülleme bu adımı önce elde edilmelidir ve (2) lipozomlar güvenli sulu çekirdek ilaç taşıyan, doğal biyofiziksel istikrarı muhafaza etmelidir. Bu araştırma hedeflerini daha istikrarlı mikronaltı lipid veziküller tasarlamak için optimize edilmiş bir yöntem olan ihtiyacı göstermektedir. Bununla birlikte, mevcut lipozom hazırlama teknolojileri (sonication 10, donma ve çözülme-10, sedimantasyon) biyofiziksel sınırlar yüksek tutarlılık ve verimlilik 10,5 ile oldukça eğimli (yani çapı &lt;100 nm) lipozomlar hazırlanmasına izin vermez Bir emergi çalışmalarımembran eğrilik algılama ng alanı. Bu yazıda, biyolojik ilgili lipozomlar çeşitli için sağlam bir hazırlama yöntemi sunuyoruz. Gaz sızdırmaz şırıngalar ve polikarbonat membran 10,5 kullanarak Manuel ekstrüzyon yaygın bir uygulamadır ama gözenek boyutları uygulanan manuel basınç değişkenliği nedeniyle nedeniyle &lt;100 nm kullanırken heterojenite sık görülmektedir. Biz, çapları 30 ile 400 nm arasında değişmektedir sentetik lipozomlar hazırlamak için sabit bir basınç kontrollü ekstrüzyon cihazları istihdam. Dinamik ışık saçılması (DLS) 10, 11 ve elektron mikroskopi nanoparçacık izleme analizi (NTA) 12 bizim protokolde tarif edildiği gibi, ticari polistiren (PS), bir kalibrasyon, standart olarak kullanıldı boncuklar ile, lipozom boyutları ölçmek için kullanılmıştır. Bir yakın doğrusal korelasyon bizim basınç kontrollü lipozom hazırlık yüksek sadakat gösteren, meslek gözenek boyutları ve deneysel olarak belirlenmiştir lipozomlar arasında anlamlı karşılandıdeme usulü. Ayrıca, bu yağ vesikül hazırlama yöntemi, çeşitli boyutlarda lipozom bağımsız olarak, genel olarak uygulanabilir olduğunu göstermiştir. Son olarak, biz de en fazla 16 saate kadar Hazırlanan bu lipozomlar stabil olduğu bir zaman ders çalışmada gösterilmiştir. A temsilcisi nano boyutlu lipozom hazırlık protokolü aşağıda gösterilmiştir.

Watch this Scientific Journal Video about Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles at JoVE.com

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Bu protokol, homojen bir yüksek derecede mikronaltı boyutlarda lipid kesecikler hazırlanması için bir çekme yöntemi açıklar. Bu yöntem, lipozom preparatı için kontrollü bir nitrojen akışı hızları ile bir basınç kontrol sistemi kullanır. Lipid hazırlanışını<sup&gt; 1,2</sup&gt;, Lipozom ekstrüzyon ve boyutu karakterizasyonu burada sunulacaktır.

Nano ölçekli Lipid Vesiküller Hazırlanması için Sabit Basınç kontrollü Ekstrüzyon Yöntemi

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

constant-pressure-controlled-extrusion-method-for-preparation-nano

Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.8K Görüntüleme.  University of Colorado Boulder. Bu protokol, homojen bir yüksek derecede mikronaltı boyutlarda lipid kesecikler hazırlanması için bir çekme yöntemi açıklar. Bu yöntem, lipozom preparatı için kontrollü bir nitrojen akışı hızları ile bir basınç kontrol sistemi kullanır. Lipid hazırlanışını 1,2, Lipozom ekstrüzyon ve boyutu karakterizasyonu burada sunulacaktır.

Video: Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Yöntem kan-beyin bariyerini bir insan hücre tabanlı bir İletişim Modelinin Hazırlanması için Geliştirilmiş

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Biyomühendislik

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

Cilt Tip I Kolajen hazırlanması için geliştirilmiş bir yöntem

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

Mikroakışkan jeti kullanarak çift katlı lipid Vesikül Üretimi

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Mika hazırlanması Yüksek Çözünürlüklü Optik Mikroskopi Görüntüleme için lipit tabakalarının Desteklenen

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Solvent destekli çift katlı lipid (SALB) Yöntemi ile biyomembran Fabrikasyon

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Katı Lipit nanopartiküller (SLNs) Hücre içi Hedefleme için başvurular

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a high-protein crambe meal that has limited value, as it is not fit for food or feed use. However, it contains proteins that could potentially make it a suitable raw material for higher-value products. The purpose of this study was to find methods of making this side stream into extruded films, showing that products with a higher value can be produced. The study mainly considered the development of material compositions and methods of preparing and extruding the material. Wheat gluten was added as a supportive protein matrix material, together with glycerol as a plasticizer and urea as a denaturant. The extrudate was evaluated with respect to mechanical (tensile testing) and oxygen barrier properties, and the extrudate structure was revealed visually and by scanning electron microscopy. A denser, more homogeneous material had a lower oxygen transmission rate, higher strength, and higher extensibility. The most homogeneous films were made at an extruder die temperature of 125-130 &#176;C. It is shown here that a film can be extruded with promising mechanical and oxygen barrier properties, the latter especially after a final compression molding step.

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

The side stream from plant oil production of Crambe abyssinica has limited value. The purpose of this study was to find methods for extruding materials based on this side stream, demonstrating that products with a higher value can be produced. The extrudates were found to have promising properties.

Film Ekstrüzyon<em&gt; Crambe abyssinica</em&gt; / Buğday Gluten Karışımları

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical development, not only their pharmaceutical activity is important but also their production needs to be evaluated. In this context, research focuses on the isolation of EVs, their characterization, and their storage. The present manuscript aims at providing a facile procedure for the assessment of the effect of different storage conditions on EVs, without genetic manipulation or specific functional assays. This makes it possible to quickly get a first impression of the stability of EVs under a given storage condition, and EVs derived from different cell sources can be compared easily. The stability measurement is based on the physicochemical parameters of the EVs (size, particle concentration, and morphology) and the preservation of the activity of their cargo. The latter is assessed by the saponin-mediated encapsulation of the enzyme beta-glucuronidase into the EVs. Glucuronidase acts as a surrogate and allows for an easy quantification via the cleavage of a fluorescent reporter molecule. The present protocol could be a tool for researchers in the search for storage conditions that optimally retain EV properties to advance EV research toward clinical application.

Here we present a readily applicable protocol to assess the storage stability of extracellular vesicles, a group of naturally occurring nanoparticles produced by cells. The vesicles are loaded with glucuronidase as a model enzyme and stored under different conditions. After storage, their physicochemical parameters and the activity of the encapsulated enzyme are evaluated.

Ekstrasellüler veziküllerin depolama Istikrarı değerlendirilmesi

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Kanser Hücre Kültürlerinden Toplanan Ortamda Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi ile Analiz Edilen Seçilmiş Kynureninlerin Eşzamanlı Nicelemesi

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure single-molecular binding kinetics, assess mechanical properties of ligand-receptor interactions, visualize protein dynamic conformational changes and more excitingly elucidate receptor mediated cell mechanosensing mechanisms. More recently, BFP has been used to measure the spring constant of molecular bonds. This protocol describes the step-by-step procedure to perform molecular spring constant DFS analysis. Specifically, two BFP operation modes are discussed, namely the Bead-Cell and Bead-Bead modes. This protocol focuses on deriving spring constants of the molecular bond and cell from DFS raw data.

A biomembrane force probe (BFP) is an in situ dynamic force spectroscopy (DFS) technique. BFP can be used to measure the spring constant of molecular interactions on living cells. This protocol presents spring constant analysis for molecular bonds detected by BFP.

Biyomembran Kuvvet Probu Spektroskopisi ile Moleküler Yay Sabit Analizi

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...