Kafes ışık sayfası mikroskobu güçlü bir görüntüleme teknolojisidir, ancak dünyadaki çok az laboratuvar bunu kullanabiliyor. Bu protokol, ticari olarak kullanılabilen kafes ışık sayfası mikroskobunun nasıl kullanılacağına ayrıntılı bir genel bakış sağlar. Moleküllerin gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak tanıyan tek tek hücrelerin veya embriyoların dört boyutlu görüntüleme yeteneğine sahip son derece güçlü bir sistemdir.
Bu tekniğin en büyük avantajı, yüksek spatiotemporal çözünürlüğü ve minimal fotoğraf ağartma ile tek canlı hücreleri veya organları üç boyutlu olarak görüntülemesidir. Işık tabakasının kafes deseni, yüksek hızlı görüntü örneklerine ulaşmamızı ve diğer tekniklerin elde edemediği moleküler ayrıntılarla üç boyutlu canlı hücre ve organların gerçek zamanlı videolarını almamızı sağlar. Bu ilk video protokolü bize kafes ışık sayfası mikroskopi dört boyutlu görüntü tek hücreli nasıl gösteren.
Bu hizalama ve örnek hazırlama nedeniyle çok karmaşık bir tekniktir. Ve görsel gösterinin, daha fazla bilim adamının biyolojideki birçok farklı molekül, hücre ve organı görüntülemesine izin vererek erişilebilirliği artıracağına inanıyoruz. Bu prosedüre başlamak için, beş milimetrelik yuvarlak kapakları oda sıcaklığında %0,1 poli-L-l-lizin ile 10 dakika kuluçkaya yatırın.
Sıvıyı aspire edin ve kapakların havasının doğal olarak kurumasına izin verin. Daha sonra, 15 mililitrelik konik bir tüpe üç mililitre yoğunluk degradesi ekleyin. Dikkatlice hücre tüp kenarına damla akıllıca ekleyin.
Santrifüj 930 kez g ve 10 dakika boyunca dört santigrat derecede. Bundan sonra, tüm ortam ile yoğunluk gradyan reaktifi arasındaki ince orta hücre tabakasını dikkatlice çıkarın ve her hücre türünü ayrı bir konik tüpe koyduğunuzdan emin olun. Hücreleri yıkamak için 5 dakika boyunca 300 kez g santrifüj.
Supernatant atın ve T-hücreleri ve CH27 hücrelerinin tüpleri rpmi beş mililitre ekleyin. Üç toplam yıkayılmış olana kadar taze RPMI ile yıkamayı tekrarlayın. Daha sonra, tam RPMI bir mililitre ile her tüp hücreleri resuspend ve bir hemositometre ile hücreleri saymak.
Tam RPMI 500 mikrolitre bir milyon antijen sunan hücreleri resuspend ve 10 mikromolar MM ekleyin. 37 derecede %5 karbondioksitle üç saat kuluçkaya yat. Bundan sonra, tam RPMI 500 mikrolitre bir milyon T-hücreleri resuspend.
Anti-TCR beta Alexa 488 FAB etiketli iki mikrogram ekleyin ve 30 dakika boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derece inkübat. Daha sonra, her iki hücreyi de 5 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. Tam RPMI 500 mikrolitre ekleyin ve hücreleri yıkamak için santrifüj tekrarlayın.
Her yıkamadan sonra süpernatantı atarak toplam üç yıkama yapılana kadar taze RPMI ile yıkayın. Bundan sonra, görüntüleme medya 500 mikrolitre her iki hücre türünü resuspend. İlk olarak, LLSM banyosu için su ve floresan 30 mikrolitre 10 mililitre ekleyin.
Nesneyi görüntü konumuna taşımak ve tek bir Bessel lazer ışını desenine bakmak için Resim Evi'ne basın. Lazer ışınını kılavuz ve önceden ayarlanmış ilgi bölgesini kullanarak hizalayın ve ışını her yönde dengelenmiş ince bir desen haline getirin. Işın da bulucu kamera odaklanmış görünmelidir.
Kirişi ayarlamak için iki ayna eğim ayarlayıcısını, üst odak mikrometresini ve nesnel rengi kullanın. Sonra, banyo ve tamamen herhangi bir floresan kaldırmak için su en az 200 mililitre ile hedefleri yıkayın. Standart floresan boncukları görüntülemek için, Xgalvo aralık kutusunda üçe ayarlayarak ayarlayıcıyı açın ve geçerli alanı görüntülemek için Live tuşuna basın.
En yüksek gri değerler için eğim aynasını, nesnel rengi ve odak mikrometresini el ile ayarlayın. Daha sonra, nesnel tetkik, Z galvo, Z artı hedef ve örnek tetkik yakalama modları için uygun desenleri elde etmek için gerektiği gibi ayarlayın. Bundan sonra, de-skewing ve de-convolution için örnek nokta yayma işlevini toplamak için örnek tetkik modunda Yürüt'e basın.
Lazerleri üç renk moduna geçin ve tekrar Çalıştır'a basın. Başlamak için, hazırlanan beş milimetre çapında dairesel kapak için 100, 000 anti-sunum hücreleri ekleyin ve onları 10 dakika yerleşmek için izin. Numune tutucuyu yağlayın ve kapak kaymasını hücre tarafına yukarı ekleyin.
Ardından, kapağın arkasına bir damla görüntüleme ortamı ekleyin. Örnek tutucuyu Piezo'ya vidala ve Image Home tuşuna basın. Görüntü için bir antijen sunan hücre bulun ve LLSM ve görüntüleme yazılımıdüzgün çalıştığından emin olun.
Geçerli görüntüyü görüntülemek için Canlı'ya basın. Kapak ve hücreleri bulmak için Z boyunca hareket edin. Z yönünde hareket ederek bir antijen sunan hücrenin merkezini bulun, sonra lazeri duraklatmak için Dur tuşuna basın.
3D'yi kontrol edin ve istediğiniz ayarları girin. Verileri toplamak için Center tuşuna basın ve ardından Yürüt'e basın. Aşamayı yük konumuna indirin ve 50 mikrolitre T-hücresi ve görüntüleme ortamını doğrudan kapağın üzerine bırakın.
Bu pipet ucu ucunda bir damla formu izin ve daha sonra banyo sıvı ucu dokunmak en iyisidir. Resim İadesi'ni tıklatarak sahneyi geri yükseltin. Görüntülemeye başla.
İstediğiniz Z yığınını ve timelapse uzunluğunu ayarladığından emin olun. Örneğin, resim 60 Z 0,4 mikrometre adım boyutunda yığınlar ve giriş 500 zaman dilimi. Fotoğraf beyazlatma önlemek için 500 kare ulaşılmadan önce kayıt durdurun.
Hücre çiftleri aramak için canlı modu kullanın ve hazır ve istenen ayarlar girildiğinde veri toplamak için Yürüt'e basın. Bu çalışmada, birincil fare 5CC7 T-hücreleri izole edilip hazırlanır ve daha sonra bir kafes ışık sayfası mikroskobu kullanılarak görüntülenir. Burada gösterilen doğru ışın yolu ve floresan ile görüntülendiğinde ışın hizalaması vardır.
Objektif talan, XZ ve YZ projeksiyonlarında mümkün olduğunca simetrik büyük bir X şekli göstermelidir. Ayrıca mümkün olduğunca küçük bir X olarak ayarlanmalıdır. Z galvo scan xz ve XY her iki tarafta tek bir nokta ile bir oval göstermelidir.
Son olarak, hem Z artı nesnel taramak hem de örnek taramak mümkün olduğunca yuvarlak görünen noktagöstermelidir. Bu protokol kullanılarak T-hücre yüzeyindeki T-hücre reseptörlerinin dört boyutlu dinamiği görülebilir. Bu mikroskobun en büyük avantajı, T-hücre reseptörlerinin görselleştirilmiş yüzey birimlerini takip edebilme ve boyutları, hareketleri, sinyal yoğunluğu ve dışkılarından sayısal laştırılmış veriler elde edebilme yeteneğidir.
Hatırlanması gereken en önemli şey hizalama kalitesidir. Kafes ışık sayfası günlük olarak hizalanmalıdır ve bunu düzgün yapmamak çarpık görüntülemeye neden olur. Benzer şekilde, psf'nin kalitesi doğrudan son görüntünün kalitesini sağlayan de-convolution kalitesini etkiler.
Bu yöntemin bu kadar güçlü olmasının nedenlerinden biri, her hücre nin ve etiketin birçok hücre tipini ve molekülü görselleştirmek için değiştirilebilmeleridir. Bu nedenle, bu yöntem moleküllerin dört boyutlu izleme ile ilgili herhangi bir soruyu cevaplamak için kullanılabilir. Bu tekniğin araştırmacıların moleküler kaçakçılık alanında yeni sorular keşfetmelerinin önünü açacağını düşünüyoruz.
Biz bu Jove video tekniğierişilebilirlik artıracak umuyoruz bu yüzden henüz yaygın olarak karmaşık sistem nedeniyle kullanılan değildir. Sistemde kullanılan lazerler sınıf 4 bu yüzden mutlak dikkatli lazer güvenliğini sağlamak için alınmalıdır. Lütfen bu yöntemi kullanmadan önce gerekli lazer güvenlik eğitimini alın.
