Name: real-time live imaging of t-cell signaling complex formation
Uploaded: 2013-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation at JoVE.com

Yazarlar teknik yardım için Sophia Fried teşekkür ederim. Hibe no.1659/08, 971/08 1503/08 491/10, hiçbir hibe Sağlık ve Bilim Bakanlıkları için İsrail Bilim Vakfı: MBS araştırma destek için aşağıdaki kurumlar teşekkür. 3-4.114 ve 3-6.540, geç Alexander Smidoda ve Emlak aracılığıyla İsrail Kanser Derneği ve Bio-tıp mükemmellik hibe için Taubenblatt Aile Vakfı.

1. T hücre transfeksiyonu <ol><li> Nucleofector Çözüm için sette en &quot;Ek&quot; çözüm karıştırılarak aktive Amaxa Nucleofector çözüm hazırlayın. Etkinleştirilmiş çözelti üç ay boyunca 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Kültür ortamı içinde, Jurkat T hücrelerinin çoğalmasını [% 10 fetal dana serumu (FCS),% 1 penisilin-Streptomisin çözeltisi ve 2 RPMI mM L-glutamin]. Optimal olarak, hücreler 1-2 hafta sonra çözülme kullanılmalıdır. Logaritmik büyüme hücre kültürleri kullanılarak yüksek transfeksiyon verimi ve hücre canlılığı açısından önemlidir. Alternatif olarak, küçük değişiklikler yapılarak, bu protokol, birincil T-hücreleri ile birlikte kullanılabilir, daha önce tarif edildiği 8. Bu, birincil T-hücreleri aktivasyonu sürecinin süresi daha uzun Jurkat T hücreleri (~ 30 dakika), bu daha olduğunu vurgulamak gerekir, bir mikroskop aşamasında inkübasyon sistemi, CO2, boyunca nem ve sıcaklığı muhafaza etmek için kullanılması gereken monte etkinleştirme işlemi. </li><li> 5 toplayın15 ml tüp içine transfeksiyon başına × 10 6 günlük fazlı T hücreleri. </li><li> 400 7 dak × g oda sıcaklığında için hücreler santrifüj. </li><li> Santrifüj sırasında, 6 oyuklu plaka hazırlanması. 37 5 ml kültür ortamı ve önceden inkübe ile her bir transfeksiyon için iyi bir doldurmak ° C </li><li> Santrifüj tüpleri toplamak ve supernatant atın. 1 ml RPMI hücre pelletini. </li><li> 400 7 dak × g oda sıcaklığında için hücreler santrifüj. </li><li> Santrifüj sırasında transfeksiyon solüsyon hazırlanır. 96 oyuklu bir plaka iyi birinde, bir floresan etiketli proteini kodlayan ilgi 5 ug plazmid DNA&#39;sı ile adım 1 &#39;de hazırlanan aktive 100 ul Amaxa Nucleofector çözeltisi karıştırın. Optimal olarak, DNA konsantrasyonu transfeksiyon solüsyonu seyreltilmesi önlemek için 1 mg / ml &#39;den daha büyük olmalıdır. </li><li> Nazik pipetleme ile iyice karıştırın. </li><li> Hücrelerin santrifüje edilmesinden sonra, dikkatli bir şekilde tüm süpernatant kaldırmak d değil ikenpelet isturbing. </li><li> DNA / transfeksiyon çözüm iki kez pipetle. </li><li> Pelet DNA / transfeksiyon solüsyonu eklenir. </li><li> Amaxa küvete hücre transfer edin. </li><li> Amaxa Nucleofector cihazın içine küvet yerleştirin. </li><li> Elektroporasyon için H-10 Amaxa transfeksiyon ayarı (Jurkat için) ya da T-23 (primer T-hücreleri için). </li><li> Inkübatör 6 plaka çıkarın. </li><li> Elektroporasyon ardından dikkatli bir Pasteur pipeti kullanılarak 6-plaka hücre süspansiyonu ile süpernatantı aktarın. Hücre artıkları oluşan pelet oluşturabilmektedir. Pelet transfer kaçının. </li><li> 37, 24 saat boyunca inkübe hücreleri ° C </li><li> Yeni bir kuyuya her bir hücre süspansiyonu 2.5 ml aktarın. Her kuyuya 2.5 ml sıcak bir kültür ortamı (adım 2&#39;de açıklandığı) ekleyin. </li><li> 72 saat sonra, 400 x g 7 dakika, oda sıcaklığında bir steril tüp ve santrifüj hücreleri aktarmak. Süpernatantı atın ve wi yerineKullanılan plazmit için uygun olan memeli hücre seçimi antibiyotik (, ​​biz, sırasıyla, 1.3 mg / ml, ve / ya da 0.2 mg / ml &#39;lik konsantrasyonlarda, G418 ve / veya Higromisin kullanılan kullanılan antibiyotiklere için uygun bir konsantrasyonda uygulanır) ile desteklenmiş inci kültür ortamı. Yeni bir kuyuda Kültür hücre süspansiyonu. Alternatif olarak hücreler, geçici olarak transfekte edilmiş ve transfeksiyondan 48 saat sonra görüntülenebilir. Geçici olarak transfekte edilmiş hücreleri hazırlamak için, adım 20 ile devam normal adım 8, eş zamanlı olarak her iki plazmid ile ko-transfekte hücreler, ve daha sonra 23 doğrudan adım geçin. Bu senaryoya göre, hücreler hemen kullanılması gerektiğini not edin ve genel olarak floresans yoğunluğunu ve heterojen bir düzeyde olmayabilir. </li><li> Uygun seçimi antibiyotik ile desteklenmiş kültür ortamı ile hücreleri büyütün. Hücreleri Split ve gerektiği gibi antibiyotik-takviye kültür ortamı ile ek. </li><li> 2 hafta sonra, FACS kullanımı (grip ile başarılı transfeksiyon doğrulamakolarak orescence ile aktive olan hücre sıralama) aşağıdaki gibidir: </li><li> 10 6 transfekte edilmiş hücreler, 10 6 sahte transfekte edilmiş hücreler (negatif kontrol) ve stabil bir şekilde floresan etiketli protein ifade etmek için bilinen 10 6 hücre toplayın. Hücrelerinin birden fazla flüoresan protein (adım 27) ile transfekte edilir ise, pozitif kontroller olarak birden fazla tek başına, etiketli hücre hatları kullanın. </li><li> 400 7 dak × g oda sıcaklığında için hücreler santrifüj. </li><li> Süpernatantı atın. 500 ul FACS tampon maddesi (PBS w / o Ca 2 + ve Mg2 +,% 5 FCS,% 0.05 sodyum azid) içinde süspanse hücreleri. </li><li> Hücresel floresan doğrulamak için analitik bir FACS kullanın. Negatif ve pozitif kontroller arasında bu için transfekte edilmiş hücrelerin floresans karşılaştır. </li><li> Transfekte hücreler kullanarak ilave olarak, flüoresan etiketli protein, tekrar adımları 3-26 ile hücreleri transfekte etmek için. </li><li> Floresans yüksek seviyeli Hücreler kullanılmalıdır. Arasında Optimal olarak, en azından% 50kültür hücreleri yüksek floresan olmalıdır. Hücre floresan FACS ile hücre sıralama artırılabilir. </li></ol> Her türlü ilave etiketli proteinlerin farklı fluorophores için sigortalı olmalıdır ve farklı bir seçim antibiyotikler için kodlama plazmid üzerinde kodlanmış. Birden fazla plazmid ile transfekte edilmiş hücreler için seçim ortamı tüm uygun antibiyotikler ile takviye edilmelidir. 2. T hücre Yayılma Testi Hazırlık <ol><li> Lab-Tek II Alman coverglass sistemi 4 oda slaytlar kullanın. Yanlışlıkla hazırlanması veya kullanım sırasında bir pipet ile örneğin odaları iç yüzeyi, sıfırdan değil emin olun. </li><li> 50-ml slayt hazırlama çözeltisi hazırlayın: 12 M (37%) HCl 4.6 ml alın, 38.5 ml% 100 etanol ve 6.9 ml iki kat distile su ekleyin. </li><li> 500 ul slayt hazırlık çözüm ile slayt her odası doldurun. </li><li> 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Odası aspires, tamamen kurutulması. </li><li> ° C kadar tamamen kuru 45 1 saat için ortaya çıkarılan slaytlar inkübe edin. </li><li> Iki kez damıtılmış su içinde% 0.1 poli-L-lisin (Sigma-Aldrich) seyreltilerek% 0.01 poli-L-lizin çözeltisi hazırlayın. </li><li> Her iki mecliste de 500 ul uygulayın. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika için slayt inkübe edin. </li><li> Tamamen kurutma, odaları aspire. </li><li> ° C kadar tamamen kuru 45 az 3 saat inkübe edin. </li><li> Kaplı slaytlar, oda sıcaklığında birkaç ay boyunca kuru saklanabilir. </li><li> Bir aktive edici antikor çözüm hazırlayın. HIT3a (BD Pharmingen # 555337) veya UCHT1 (BD Pharmingen # 555330), oda başına 400 ul PBS içinde 10 ug / ml ya da: bir anti-CD3 antikoru kullanın. Bu çözüm kısa bir süre slayt hazırlama önce hazırlanmalıdır. </li><li> Aktive edici antikor çözeltisi 400 ul her bir göze doldurulabilir. </li><li> Gece boyunca 4 °, tercihen 37 ° C veya daha, önceki 2 saat için slayt inkübe ° C. </li><li> Aktive antikor sol kaldırmaution ve hemen 300 ul PBS ile iki kez odasına yıkayın. Bu noktadan sonra, odaları tampon dolu kalır emin olun. </li><li> 4 ° C de PBS-dolu bir slayt Mağaza Biz 1 hafta içinde hazırlanan slayt odaları kullanmanızı öneririz. </li></ol> 3. T hücre aktivasyonu ve Görüntüleme <ol><li> [1,25 ml HEPES (1 M) ile, 10 mL FCS, 38.75 ml RPMI fenol kırmızısı olmadan] görüntüleme tamponu hazırlayın. Görüntüleme tampon 4 ° C&#39;de süzülerek saklanabilir. </li><li> Zeiss LSM 510 Meta mikroskop etkinleştirin. 37 için mikroskop ısıtılabilir montaj çerçevesi Sıcak ° C &quot;Uzman modu&quot; seçeneğini seçin. </li><li> &quot;Edinme&quot; sekmesine tıklayın ve aşağıdaki sekmeler açın: Lazerler, Mikroskopi, Yapılandırma, Tarama, Zaman Serisi. </li><li> Gerekli lazerler etkinleştirin. AÇSAP ağırlıklı ve mYFP, uyarma için daha sonra &quot;açık&quot; 5 dakika &quot;bekleme&quot; için Argon / 2 lazer, ayarlayın. </li><li> Aynı fluorophores kullanarak önce bu canlı hücre görüntüleme testi gerçekleştirdiyseniz, ortaya çıkan LSM dosyayı açmak, i &quot;yeniden&quot; tıklayıncon ve adım 9 yerden devam. Aksi takdirde adım 6 devam edin. </li><li> Kullanılan floresan proteinlerin uyarma ve emisyon için uygun filtreleri kullanarak kanalları tanımlayın. </li><li> &quot;Tarama kontrol&quot; penceresinde, Z yığını seçeneğini seçin. </li><li> 0.5 mikron; Şu dilim: 3;: dilim sayısı: Aralığı 5 aşağıdaki tarama parametreleri girin. </li><li> Mikroskop yakın 37 bir Accublock Dijital Kuru Banyo (Labnet) ° C hazırlayın. </li><li> 37 ° C&#39;ye ısıtın görüntüleme tampon </li><li> Sıcak görüntüleme tampon 600 ul ile değiştirilmesi, PBS aspire saklanan slayt hazırlayın. </li><li> 37 slayt inkübe ° C Adım 13 kadar, en az 15 dakika için inkübatör slayt tutun. </li><li> 5 toplayın x 10 5 transfekte edilmiş T hücreleri. </li><li> 400 × g 2 dakika hücreleri santrifüj. </li><li> Süpernatantı atın. </li><li> 1 ml sıcak görüntüleme tampon tekrar süspansiyon hücreleri ve 1.5 ml Eppendorf tüp aktarabilirsiniz. </li><li> T yerleştirinAccublock Dijital Kuru Bath ile ilgili est tüp. </li><li> Inkübatör ısıtılmış slayt alın ve ısıtılmış mikroskop montaj çerçevesi üzerine monte. </li><li> &quot;VIS&quot; simgesine tıklayın. </li><li> Hücre süspansiyonu karıştırın ve 1-2 ul çıkarın. </li><li> Slayt alt üzerinde görüntüleme tampona pipet ucu yerleştirin. Slayt çizilmesini önlemek. </li><li> Amacı en diyafram üzerinde tohum hücreleri. </li><li> Onlar iner gibi hemen görsel floresan hücreleri izlemeye başlar. Iki kanal yüksek floresan görüntüleyen bir hücre seçin. </li><li> Hücre slayt yüzeyine ulaşmadan önce, LSM modunu etkinleştirin. </li><li> Sadece bir uyarma lazer geçiş. Bir DIC kanal sahip olduğunuz bir lazer seçin. </li><li> 1 Zoom ayarlayın. &quot;Hızlı XY&quot; simgesine tıklayın. &quot;Dur&quot; simgesine tıklayın. Kırpma aracını kullanarak, hücre merkezli bir yatırım getirisi seçin. </li><li> 3 Zoom ayarlayın. &quot;Hızlı XY&quot; simgesini tıklatın, sonra el en iyi şekilde hücre görmek için odağı ayarlayın. &quot;Dur&quot; ico tıklayınn. </li><li> Tüm gerekli uyarma lazerler geçiş. </li><li> &quot;StartT&quot; ikonuna tıklayarak kayıt başlayın. Resim yayılma süreci (genellikle 5 dakika) bütünlüğü için hücre. Bittiğinde, &quot;Dur&quot; simgesini tıklatın. </li><li> Dosyayı kaydedin. </li><li> Ek hücreleri elde etmek için, &quot;VIS&quot; simgesini tıklatın. Henüz slayt alt temas gelmedi hücre varsa, adım 23 devam. Zaten yayılma süreci başladı görüntüleme hücreleri kaçının. Aksi halde 32 adıma geçin. </li><li> Gözlemlenen slayt alan hücreler çoğunlukla yoksun ise, hücreler (adım 20 ile devam edin) başka bir kısım ekleyin. Aksi halde 33 adıma geçin. </li><li> Ek hücreler elde etmek için, objektif en açıklık üzerindeki alana hücrelerinden yoksun olduğunu kaydırmak. </li><li> Hücreleri (ve adım 20 ile devam eder) bir başka kısım ekleyin. </li><li> Tüm istenen görüntüleme yaptıktan sonra, kaydedilmiş bir EKK dosyasını açın. </li><li> &quot;Galeri&quot;, &quot;Zaman + Z&quot; ve &quot;alt kümesi&quot; tıklayın. </li><li> Relevan seçint zaman aralığı ve Z yığını. </li><li> Yeni dosyayı kaydedin. </li><li> Tüm görüntüleme dosyalar için adımları 35-38 gerçekleştirin. </li></ol> 4. Görüntüleme Veri Analizi <ol><li> Imaris yazılım (Bitplane AG, Zürih İsviçre) kullanarak LSM dosyaları açın. </li><li> &quot;Aşan&quot; tıklayın. &quot;Görüntü İşleme&quot; menüsüne tıklayın ve &quot;Zaman ve Z Swap&quot; seçin. Bu, görüntünün doğru kırpma yardımcı olacaktır. </li><li> &quot;Düzenle&quot; araç çubuğu tıklayın ve açılan menüde &quot;Kes 3D&quot; seçeneğini seçin. Hücre çevresindeki sadece alanı bulunmaktadır görüntü kırpın. Biz hücre merkezli bir 300 × 300 piksel kare kırpma öneririz. Hücresinin şekli ve yeri zamanla değişebilir unutmayın. T ekseni Gözlem, hücre her zaman noktalarında kırpılmış bölge içinde olduğundan emin olun. </li><li> &quot;Görüntü İşleme&quot; menüsüne tıklayın ve resmin orijinal zamansal ayrılık geri yüklemek için &quot;Zaman ve Z Swap&quot; seçin. </li><li> Ana araç çubuğunda &quot;COLOC&quot; düğmesine basın. &quot;De Zaman Yapı seçins. COLOC &quot;. Imaris otomatik olarak her zaman noktasında her kanal için yoğunluk eşik hesaplar. </li><li> &quot;Kanal İstatistik&quot; seçerek ko analiz sonuçlarını görüntülemek. &quot;İhracat&quot; tıklayarak veri verir. </li><li> Her görüntülü hücre için 6 Adım 1 tekrarlayın. Biz en az 50 hücre bu şekilde analiz edilmesi önerilir. </li><li> Ortalama Pearson ko katsayısı ve standart hata veya sapma hesaplayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Viret, C., Janeway, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+and+T+cell+development.">MHC and T cell development.</a> Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).</li><li>Risso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+antimicrobial+peptides:+multifunctional+effector+molecules+of+innate+immunity.">Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity.</a> J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).</li><li>Doherty, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+cell+effector+and+memory+function+in+viral+immunity.">Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).</li><li>Jager, D., Jager, E., Knuth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+tumour+antigens:+implications+for+antigen+specific+immunotherapy+of+cancer.">Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer.</a> J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).</li><li>Davis, M. M., Bjorkman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+antigen+receptor+genes+and+T-cell+recognition.">T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition.</a> Nature. 334, 395-402 (1988).</li><li>Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+cytoskeleton+in+T+cell+activation.">The actin cytoskeleton in T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).</li><li>Reicher, B., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+pathways+leading+from+the+T-cell+antigen+receptor+to+the+actin+cytoskeleton+network.">Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network.</a> FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).</li><li>Barda-Saad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+molecular+interactions+linking+the+T+cell+antigen+receptor+to+the+actin+cytoskeleton.">Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton.</a> Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).</li><li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+actin+polymerization+drives+T+cell+receptor-induced+spreading:+a+role+for+the+signal+transduction+adaptor+LAT.">Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT.</a> Immunity. 14, 315-329 (2001).</li><li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action.">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296, 913-916 (2002).</li><li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+colocalization+by+correlation:+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander's+overlap+coefficient.">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient.</a> Cytometry A. 77, 733-742 (2010).</li><li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells.">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).</li><li>Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosines+113,+128,+and+145+of+SLP-76+are+required+for+optimal+augmentation+of+NFAT+promoter+activity.">Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity.</a> J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).</li><li>Wunderlich, L., Farag&#243;, A., Downward, J., Buday, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Nck+with+tyrosine-phosphorylated+SLP-76+in+activated+T+lymphocytes.">Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes.</a> Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).</li><li>Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cooperation+between+the+proteins+Nck+and+ADAP+is+fundamental+for+actin+reorganization.">Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization.</a> Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).</li><li>Barda-Saad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+interactions+at+the+SLP-76+complex+are+critical+for+actin+polymerization.">Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization.</a> EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).</li><li>Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3 (2012).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir çıkar çatışması var.

Çoklu hücresel süreçlerin düzenlenmesi ve fonksiyonu protein-protein etkileşimleri oluşumu ve sonlandırma bağlıdır. Mikroskobik görüntüleme canlı hücrelerde floresan etiketli proteinlerin gerçek zamanlı izleme sağlar. Işaretlenmiş olan proteinlerin ko proteinler arasında doğrudan veya dolaylı olarak etkileşime önerebilir ve bu immüno-çökeltme gibi biyokimyasal yöntemler ile elde edilen bulguların güçlendirmek için kullanılabilir. Biyokimyasal yöntemler farklı olarak, canlı hücre görüntüleme bu arası protein etkileşimleri ortaya gibi fizyolojik süreçlerin izlenmesi kolaylaştırmak ve proteinlerin hücresel dağılımının saptanması, uzaysal ve bu süre boyunca gözlem sağlar. Ko kantitatif analiz için çeşitli araçlar geliştirilmiştir; Pearson korelasyon katsayısı iki protein 12 arasındaki ko derecesi ölçümü için çok çekici ve yaygın olarak kullanılan yöntem olmaya devam etmektedir. Da floresan rezonans Energy transferi (FRET) deneyleri yakın (10 nm) ile karakterize arası protein etkileşimleri tespiti sağlamak, bu yöntem özel ayarları (kullanılan floresan etiketlemeleri ekipman ve uyumluluk) ve karmaşık bilgi işlem gerektirir. Çoğu kullanım, ko analizi için, biyokimyasal yöntemler ile birleşik olarak, bir kolay kullanımlı için teşkil eder ve zaman içinde protein-protein etkileşimleri gözlemlemek için basit bir yöntem. Ya kanal için yoğunluğu eşiğin altına piksel görmezden, analiz piksel için bir floresan yoğunluklu eşik kurulması doğru ve hassas ko analiz için kritik önem taşımaktadır. Bu eşik amacı ve otomatik belirlenmesi için yaygın olarak kullanılan algoritma 13. Costes ve arkadaşları tarafından geliştirilen ve bu Imaris ve Volocity gibi görüntü işleme programları tarafından yürütülmektedir. Burada, canlı T-hücresi görüntüleme bölgesinin kullanımını göstermekSLP76 dinamiklerini analiz etmek için metodunu, önemli bir T-hücrelerinde, iskele ve Nck, bir adaptör protein, her ikisi de T-hücresi aktivasyonu için gerekli olan 14,15. Etkinleştirme sırasında toplanan T hücrelerinin Görüntüleri iki protein (Şekil 3), hücresel aktivasyon sürecinde kolokalize olduğunu göstermektedir. Bu nicel etkinleştirme işlemi boyunca toplanan görüntülerde Pearson ko testi pekiştirilmiştir. -1 -1 Bir puan anti-korelasyon anlamına gelir 1, için Pearson ko katsayıları aralığı, 1 puan mükemmel ko ve 0 anlamına gelir iki görüntü kanallar arasında bir ilişki anlamına gelir. Farklı zaman noktaları için ve farklı hücreler için hesaplanan Pearson ko katsayılarının karşılaştırılması Nck ve SLP76 bu ko önemli hücresel aktivasyonu sırasında değişmez gösterir, ancak (p&gt; 0.3, Şekil 4) sabit kalır. Da genel ko eşBu proteinlerin verimli aktivasyon süreci boyunca değişmez, bu dernek ve bu proteinlerin 18 arasında meydana gelen ayrışma dinamik bir süreç olasılığını ortadan kaldırmaz. Biz sunulan protokol de gerekir, gibi hücre büyüme koşullarının ayarlanması, söz konusu hücre çizgisi bir transfeksiyon için uygun ayar seçilmesi ve eğer varsa, hücresel aktivasyon işlemi değiştirerek diğer hematopoietik hücre hatları için adapte edilebilir. Biz uygun ayarların kullanımı ile, LSM 510 Meta konfokal mikroskop kullandı, diğer konfokal mikroskopi sistemleri başarıyla de kullanılabilir lütfen unutmayın. Canlı T hücre görüntüleme kullanımı biyokimyasal ve moleküler yöntemler kullanılarak zamansal ve mekansal çözünürlükte kullanılamaz ile keşfedilmeyi sinyal olaylar sağlayan, düzenleyici ve aktivasyon işlemleri doğrudan takip edilmesine olanak sağlamaktadır. Biz basit bir meth mevcut, canlı bir T hücre yayılan deneyi yürüten gerçek zamanlı olarak ilgili proteinler izleme ve nicel sonuçlar için verileri analiz için od. Sonuç mikroskobu veriler de bu tür hücre-şekil indeksi analizi gibi diğer downstream uygulamalar, 16 için kullanılan ve özel deney düzeneği ve araştırma amacına göre, analiz 17,18 FRET edilebilir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagent/Material&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Amaxa human T Cell nucleofector kit</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Anti CD3 (UCHT1 clone) </td><td>BioLegend</td><td>300432</td><td></td></tr><tr><td>Falcon FACS Tubes</td><td>Becton Dickinson</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>HyClone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Calbiochem</td><td>345810</td><td></td></tr><tr><td>German coverglass system 4 chamber slides </td><td>Lab-Tek II</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Bio Lab</td><td>8410501</td><td></td></tr><tr><td>Hepes </td><td>Biological Industries</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>Hygomycin</td><td>Enzo</td><td>ALX-380-306</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine </td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin </td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine 0.1 % (w/v) in H2O</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R87589</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt; </td></tr><tr><td>Accublock digital dry bath</td><td>Labnet</td><td>D1105A</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta</td><td></td></tr><tr><td>Heatable mounting frame - Heating Insert P S </td><td>PeCon</td><td>130-800-031</td><td></td></tr><tr><td>TempModule S (required for the heatable mounting frame)</td><td>Zeiss</td><td>411860-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation device</td><td>Amaxa</td><td>Nucleofector I</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence activated cell sorter</td><td>Becton Dickinson</td><td>FACSVantage SE</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Bitplane</td><td>7.0.0</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time live imaging of t-cell signaling complex formation

Bulaşıcı hastalıklara karşı koruma bağışıklık sistemi 1,2 aracılık eder. T lenfositleri birden fazla bağışıklık hücrelerinin 3,4 aktivasyonu ve yanıtları düzenleyen, bağışıklık sisteminin ana koordinatör vardır. T-hücresi aktivasyonu antijen sunan hücreler (APC) tarafından gösterilen spesifik antijen tanınması bağlıdır. T-hücresi antijen reseptörü (TCR), her T-hücresi klonu özgüdür ve antijen özgüllüğü 5 belirler. Antijene TCR bağlayıcı TCR kompleksinin bileşenlerinin fosforilasyonu neden olur. T-hücresi aktivasyonunu teşvik etmek için, bu sinyali gibi TCR proteinlerin sinyal alımı gibi çeşitli önemli tepkiler başlatarak, zardan sitoplazma ve çekirdeğe transduse olmalıdır, APC Alanı (bağışıklık sinaps), molekül aktivasyonu, sitoskeletal düzenlenmesi, hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun yükselmesi ve gen ekspresyonu 6,7 değişiklikler. Doğruaktive sinyallerin itiation ve sonlandırılması uygun T hücre yanıtları için çok önemlidir. Sinyal proteinlerinin aktivitesi protein-protein etkileşimleri oluşumu ve sonlandırma bağlıdır, bu tür protein fosforilasyonu, protein kompleksleri, ve protein ubiquitylation çeşitli hücresel sitelerinin 8 proteinlerin işe oluşumu gibi translasyon sonrası modifikasyonlar. T-hücre aktivasyonu sürecinin iç işleyişini anlamak immünolojik araştırma ve klinik uygulamaları için çok önemlidir. Çeşitli testler protein-protein etkileşimleri araştırmak için geliştirilmiştir, ancak bu yaygın olarak kullanılan ortak immunoprecipitation yöntemi olarak biyokimyasal testleri, böylece hücresel dinamikleri içine değerli bilgiler gözlem engelleyen, protein konumu ayırt izin yok mekanizmaları. Ayrıca, bu toplu testlerin genellikle t farklı aşamalarında olabilir birçok farklı hücrelerden protein birleştirmeko hücresel süreci incelenmiştir. Bu zamansal çözünürlüğe üzerinde zararlı etkisi olabilir. Canlı hücrelerin gerçek zamanlı görüntülemenin kullanımı dolayısıyla sürecin 9,10 dinamikleri üzerinde ışık tutan, proteinlerin mekansal izleme ve geçici olarak sinyal olayları birbirinden ayırt etmek yeteneği hem de sağlar. Biz T-hücre aktivasyonu sırasında sinyal-kompleks oluşumunun gerçek zamanlı görüntüleme bir yöntem mevcut. Primer T-hücreleri veya bu gibi Jurkat T-hücre, fizyolojik olmayan bir oligomerizasyon 11 önlenmesi, monomer cinsi floresan proteinleri ile kaynaşmış ilgi proteinleri için kodlayan plazmid ile transfekte edilir. • Canlı hücreler, spesifik antijen için aktive ihtiyacının üstesinden gelinir ise T-hücresi aktivasyonunu uyaran, CD3/TCR kompleksine bağlanan T-hücresi aktive edici antikor 8,9, bir lamel ile önceden kaplanmış üzerinde bırakılır. Aktif hücreleri sürekli konfokal mikroskopi kullanımı ile görüntülü. Görüntüleme veriler, col gibi kantitatif sonuçlar, verim için analiz edilirsinyal proteinlerinin ocalization katsayısı.

Biz canlı T-hücre görüntüleme ve analiz bir örnek sunuyoruz. Görüntüleme deney öncesinde, SLP76 eksikliği T hücreleri (J14) floresan protein (Şekil 1) ifadesinin saptanması için FACS kullanımı ile analiz edilmiştir. Etiketli sinyal proteinleri AÇSAP ağırlıklı-Nck ve SLP76-mYFP ile transfekte T hücreleri aktive slaytlar üzerinde biriken ve T-hücre yayılan (Şekil 2) sırasında görüntülendi. Toplanan görüntüleri aktivasyon ve (Şekil 3) yayılan boyunca protein yerelleştirme dinamiklerini göstermektedir. Insan önyargı en aza indirirken bilgisayarlı görüntü işleme, yeni anlayışlar ve görsel hücrelerden kantitatif bilgi sağlar. Hücresel aktivasyon sürecinde iki proteinin ko incelemek için, Imaris yazılımı (Bitplane AG, Zürich İsviçre) ko aleti kullanılmaktadır. Görüntülü hücreler boyunca farklı zaman noktaları arasında ko katsayıları karşılaştırarak, biz<html> Nck ve SLP76 en ko T-hücre aktivasyonu (p&gt; 0.3) (Şekil 4) boyunca önemli bir değişiklik olmadığını tespit etmek mümkün. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50076/50076fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50076/50076fig1.jpg" /> Şekil 1. (B) mYFP,,. Hücrelerinin FACS analizi çift veri (A) &#39;AÇSAP ağırlıklı için floresan yoğunluğu histogramlar olarak gösterilmiştir floresan-etiketli proteinleri ile transfekte edilmiş ve (C), bir nokta arsa olarak. AÇSAP ağırlıklı-Nck ve SLP76-mYFP ile transfekte J14 hücrelerin floresan sırasıyla, kırmızı ve sarı temsil edilmektedir. Untransfected J14 negatif kontrol hücreleri siyah çizgiler ile gösterilir. / Files/ftp_upload/50076/50076fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. Canlı bir şematik T hücre analizi yayılan (A) T hücre aktive slaytların hazırlanması;. (B) T hücre yayılan tahlil ve analiz yaşıyor;. (C) mikroskopi kurulum <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50076/50076fig2large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50076/50076fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50076/50076fig3.jpg" /> Şekil 3,. AÇSAP ağırlıklı-Nck ve SLP76-mYFP eksprese eden bir T-hücresi aktivasyonu işlemi sırasında Nck ve SLP76 dağılımı. Hücreler, anti-CD3 antikoru uyarıcı önceden kaplanmış lameller üzerinde bırakılan ve sürekli olarak 7 dakikalık bir süre için görüntülendi. SLP76-mYFP sarı gösterilir ise AÇSAP ağırlıklı-Nck, mavi ile temsil edilir. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;her zaman&quot;&gt; <img alt="Şekil 4," fo:content-width="4.4in" fo:src="/files/ftp_upload/50076/50076fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50076/50076fig4.jpg" /> Şekil 4. Protein ko kantitatif analizi. Hücrelerin Görüntü işleme Imaris yazılım (Bitplane AG, Zürih İsviçre) kullanılarak yapıldı. Ko AÇSAP ağırlıklı kanalın yoğunluğu ve her piksel için mYFP kanal arasında Pearson korelasyon katsayısı olarak hesaplanır. Farklı zaman noktalarında hesaplanan Pearson ko katsayıları karşılaştırılmıştır. Otuz saniye aktivasyon sürecine, AÇSAP ağırlıklı-Nck ve SLP76-mYFP en ko katsayısı (p &lt;0.05) önemli ölçüde artmıştır. Bu sonuçlar,&gt; 50 bağımsız hücreler analiz ile hesaplanmıştır. Ortalama ± standart hata gösterilir.

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation at JoVE.com

T Hücresi Sinyal Kompleksi Oluşumunun Gerçek Zamanlı Canlı Görüntülenmesi | İmmünoloji ve Enfeksiyon | Video

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Biz T-hücre aktivasyonu işlemi sırasında protein dinamiği içgörü sağlayan bir canlı hücre görüntüleme yöntem açıklanmaktadır. Bu kantitatif sonuçlar T-hücresi aktivasyonu boyunca kompleks oluşumu sinyalizasyon takip vermek üzere T-hücresi yayılmasını tahlilinde, konfokal mikroskopi ve görüntü analizi, kombine kullanımını göstermektedir.

T hücre gerçek zamanlı Canlı Görüntüleme Kompleks Oluşum Sinyal

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

real-time-live-imaging-of-t-cell-signaling-complex-formation

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Cellular Processes

Cell Signaling

SCIENTISTS IN ACTION

13.6K Görüntüleme.  Bar-Ilan University. Biz T-hücre aktivasyonu işlemi sırasında protein dinamiği içgörü sağlayan bir canlı hücre görüntüleme yöntem açıklanmaktadır. Bu kantitatif sonuçlar T-hücresi aktivasyonu boyunca kompleks oluşumu sinyalizasyon takip vermek üzere T-hücresi yayılmasını tahlilinde, konfokal mikroskopi ve görüntü analizi, kombine kullanımını göstermektedir.

Video: Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the structure-function relationship of these receptors in situ, we need to visualize and track them on the live cell surface with enough spatiotemporal resolution. Here we show how to use recently developed Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) to image T-cell receptors (TCRs) four-dimensionally (4D, space and time) at the live cell membrane. T cells are one of the main effector cells of the adaptive immune system, and here we used T cells as an example to show that the signaling and function of these cells are driven by the dynamics and interactions of the TCRs. LLSM allows for 4D imaging with unprecedented spatiotemporal resolution. This microscopy technique therefore can be generally applied to a wide array of surface or intracellular molecules of different cells in biology.

The goal of this protocol is to show how to use Lattice Light-Sheet Microscopy to four-dimensionally visualize surface receptor dynamics in live cells. Here T cell receptors on CD4+ primary T cells are shown.

Yüzey T-Hücre Reseptör Dinamiklerini Dört Boyutlu Olarak Kafes Işık Sayfası Mikroskobu Kullanarak Görselleştirme

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Biyokimya

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

Görüntüleme İmmünoloji Synapse Dynamics için bir Endotel Hücre Modeli Düzlemsel

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Iltihaplı Dermisinde içinde görüntüleme CD4 + T hücre Geçiş Göç

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskopi Verilerinin uzay-zamansal Görüntü Korelasyon Spektroskopisi nicel T Hücreleri kortikal Aktin Akışı

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological synapse, a stereotyped cell-cell junction that regulates T cell activation and directionally targets effector responses. To study these processes effectively, an imaging approach that is tailored to capturing fast, polarized responses is necessary. This protocol describes such a system, which is based on a photoactivatable peptide-major histocompatibility complex (pMHC) that is non-stimulatory until it is exposed to ultraviolet light. Targeted decaging of this reagent during videomicroscopy experiments enables precise spatiotemporal control of TCR activation and high-resolution monitoring of subsequent cellular responses by total internal reflection (TIRF) imaging. This approach is also compatible with genetic and pharmacological perturbation strategies. This allows for the assembly of well-defined molecular pathways that link TCR signaling to the formation of the polarized cytoskeletal structures that underlie the immunological synapse.

This protocol describes an imaging-based method to activate T lymphocytes using photoactivatable peptide-MHC, enabling precise spatiotemporal control of T cell activation.

T hücre aktivasyonu Photoactivatable Agonist kullanarak kayma ve Temporal kontrolünü

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

Periferik kan ve lenf dokusu birincil insan T hücre sinaptik arabirimi değerlendirilmesi

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Imaging the Human Immunological Synapse

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) and an effector helper T lymphocyte (Th) cell, and to record the images corresponding to the first stages of the IS formation and the subsequent trafficking events (occurring both in the APC and in the Th cell). These events will eventually lead to polarized secretion at the IS. In this protocol, Jurkat cells challenged with Staphylococcus enterotoxin E (SEE)-pulsed Raji cells as a cell synapse model was used, because of the closeness of this experimental system to the biological reality (Th cell-APC synaptic conjugates). The approach presented here involves cell-to-cell conjugation, time-lapse acquisition, wide-field fluorescence microscopy (WFFM) followed by image processing (post-acquisition deconvolution). This improves the signal-to-noise ratio (SNR) of the images, enhances the temporal resolution, allows the synchronized acquisition of several fluorochromes in emerging synaptic conjugates and decreases fluorescence bleaching. In addition, the protocol is well matched with the end point cell fixation protocols (paraformaldehyde, acetone or methanol), which would allow further immunofluorescence staining and analyses. This protocol is also compatible with laser scanning confocal microscopy (LSCM) and other state-of-the-art microscopy techniques. As a main caveat, only those T cell-APC boundaries (called IS interfaces) that were at the right 90&#176; angle to the focus plane along the Z-axis could be properly imaged and analyzed. Other experimental models exist that simplify imaging in the Z dimension and the following image analyses, but these approaches do not emulate the complex, irregular surface of an APC, and may promote non-physiological interactions in the IS. Thus, the experimental approach used here is suitable to reproduce and to confront some biological complexities occurring at the IS.

This protocol images both the immunological synapse formation and the subsequent polarized secretory traffic towards the immunological synapse. Cellular conjugates were formed between a superantigen-pulsed Raji cell (acting as an antigen-presenting cell) and a Jurkat clone (acting as an effector helper T lymphocyte).

İnsan İmmünolojik Sinaps Görüntüleme

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) ...

<meta charset="utf8"></head><body>T hücrelerinde Ca2+ mikro alanları tespit etmek için yüksek çözünürlüklü görüntüleme tekniği

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and might already determine the fate of a T cell. Upon T cell receptor activation, NAADP is formed rapidly, binding to NAADP binding proteins (HN1L/JPT2, LSM12) and their respective receptors (RyR1, TPC2) sitting on intracellular Ca2+ stores, like the ER and lysosomes, and leading to subsequent release and elevation of [Ca2+]i. To capture these fast and dynamically occurring Ca2+ signals, we developed a high-resolution imaging technique using a combination of two Ca2+ indicators, Fluo-4 AM and FuraRed AM. For postprocessing, an open-source, semi-automated Ca2+ microdomain detection approach was developed based on the programming language Python. Using this workflow, we are able to reliably detect Ca2+ microdomains on a subcellular level in primary murine and human T cells in high temporal and spatial resolution fluorescence videos. This method can also be applied to other cell types, like NK cells and murine neuronal cell lines.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spot Işığı: Terapötik Müdahale için Adaptif Bağışıklık Tepkisinin İlk Aktivasyonunun Çözülmesi

Here, we provide a comprehensive protocol to resolve initial local Ca2+ signals, known as Ca2+ microdomains, in primary murine and human T cells using fluorescence microscopy. This protocol serves as a valuable resource for researchers examining Ca2+ signaling pathways within immune cells and to further unravel their function.

Primer T Hücrelerinde İlk Ca2+ Mikro Alanlarının Görüntülenmesi

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...