Yazarlar teknik yardım için Sophia Fried teşekkür ederim. Hibe no.1659/08, 971/08 1503/08 491/10, hiçbir hibe Sağlık ve Bilim Bakanlıkları için İsrail Bilim Vakfı: MBS araştırma destek için aşağıdaki kurumlar teşekkür. 3-4.114 ve 3-6.540, geç Alexander Smidoda ve Emlak aracılığıyla İsrail Kanser Derneği ve Bio-tıp mükemmellik hibe için Taubenblatt Aile Vakfı.

1. T hücre transfeksiyonu <ol><li> Nucleofector Çözüm için sette en &quot;Ek&quot; çözüm karıştırılarak aktive Amaxa Nucleofector çözüm hazırlayın. Etkinleştirilmiş çözelti üç ay boyunca 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Kültür ortamı içinde, Jurkat T hücrelerinin çoğalmasını [% 10 fetal dana serumu (FCS),% 1 penisilin-Streptomisin çözeltisi ve 2 RPMI mM L-glutamin]. Optimal olarak, hücreler 1-2 hafta sonra çözülme kullanılmalıdır. Logaritmik büyüme hücre kültürleri kullanılarak yüksek transfeksiyon verimi ve hücre canlılığı açısından önemlidir. Alternatif olarak, küçük değişiklikler yapılarak, bu protokol, birincil T-hücreleri ile birlikte kullanılabilir, daha önce tarif edildiği 8. Bu, birincil T-hücreleri aktivasyonu sürecinin süresi daha uzun Jurkat T hücreleri (~ 30 dakika), bu daha olduğunu vurgulamak gerekir, bir mikroskop aşamasında inkübasyon sistemi, CO2, boyunca nem ve sıcaklığı muhafaza etmek için kullanılması gereken monte etkinleştirme işlemi. </li><li> 5 toplayın15 ml tüp içine transfeksiyon başına × 10 6 günlük fazlı T hücreleri. </li><li> 400 7 dak × g oda sıcaklığında için hücreler santrifüj. </li><li> Santrifüj sırasında, 6 oyuklu plaka hazırlanması. 37 5 ml kültür ortamı ve önceden inkübe ile her bir transfeksiyon için iyi bir doldurmak ° C </li><li> Santrifüj tüpleri toplamak ve supernatant atın. 1 ml RPMI hücre pelletini. </li><li> 400 7 dak × g oda sıcaklığında için hücreler santrifüj. </li><li> Santrifüj sırasında transfeksiyon solüsyon hazırlanır. 96 oyuklu bir plaka iyi birinde, bir floresan etiketli proteini kodlayan ilgi 5 ug plazmid DNA&#39;sı ile adım 1 &#39;de hazırlanan aktive 100 ul Amaxa Nucleofector çözeltisi karıştırın. Optimal olarak, DNA konsantrasyonu transfeksiyon solüsyonu seyreltilmesi önlemek için 1 mg / ml &#39;den daha büyük olmalıdır. </li><li> Nazik pipetleme ile iyice karıştırın. </li><li> Hücrelerin santrifüje edilmesinden sonra, dikkatli bir şekilde tüm süpernatant kaldırmak d değil ikenpelet isturbing. </li><li> DNA / transfeksiyon çözüm iki kez pipetle. </li><li> Pelet DNA / transfeksiyon solüsyonu eklenir. </li><li> Amaxa küvete hücre transfer edin. </li><li> Amaxa Nucleofector cihazın içine küvet yerleştirin. </li><li> Elektroporasyon için H-10 Amaxa transfeksiyon ayarı (Jurkat için) ya da T-23 (primer T-hücreleri için). </li><li> Inkübatör 6 plaka çıkarın. </li><li> Elektroporasyon ardından dikkatli bir Pasteur pipeti kullanılarak 6-plaka hücre süspansiyonu ile süpernatantı aktarın. Hücre artıkları oluşan pelet oluşturabilmektedir. Pelet transfer kaçının. </li><li> 37, 24 saat boyunca inkübe hücreleri ° C </li><li> Yeni bir kuyuya her bir hücre süspansiyonu 2.5 ml aktarın. Her kuyuya 2.5 ml sıcak bir kültür ortamı (adım 2&#39;de açıklandığı) ekleyin. </li><li> 72 saat sonra, 400 x g 7 dakika, oda sıcaklığında bir steril tüp ve santrifüj hücreleri aktarmak. Süpernatantı atın ve wi yerineKullanılan plazmit için uygun olan memeli hücre seçimi antibiyotik (, ​​biz, sırasıyla, 1.3 mg / ml, ve / ya da 0.2 mg / ml &#39;lik konsantrasyonlarda, G418 ve / veya Higromisin kullanılan kullanılan antibiyotiklere için uygun bir konsantrasyonda uygulanır) ile desteklenmiş inci kültür ortamı. Yeni bir kuyuda Kültür hücre süspansiyonu. Alternatif olarak hücreler, geçici olarak transfekte edilmiş ve transfeksiyondan 48 saat sonra görüntülenebilir. Geçici olarak transfekte edilmiş hücreleri hazırlamak için, adım 20 ile devam normal adım 8, eş zamanlı olarak her iki plazmid ile ko-transfekte hücreler, ve daha sonra 23 doğrudan adım geçin. Bu senaryoya göre, hücreler hemen kullanılması gerektiğini not edin ve genel olarak floresans yoğunluğunu ve heterojen bir düzeyde olmayabilir. </li><li> Uygun seçimi antibiyotik ile desteklenmiş kültür ortamı ile hücreleri büyütün. Hücreleri Split ve gerektiği gibi antibiyotik-takviye kültür ortamı ile ek. </li><li> 2 hafta sonra, FACS kullanımı (grip ile başarılı transfeksiyon doğrulamakolarak orescence ile aktive olan hücre sıralama) aşağıdaki gibidir: </li><li> 10 6 transfekte edilmiş hücreler, 10 6 sahte transfekte edilmiş hücreler (negatif kontrol) ve stabil bir şekilde floresan etiketli protein ifade etmek için bilinen 10 6 hücre toplayın. Hücrelerinin birden fazla flüoresan protein (adım 27) ile transfekte edilir ise, pozitif kontroller olarak birden fazla tek başına, etiketli hücre hatları kullanın. </li><li> 400 7 dak × g oda sıcaklığında için hücreler santrifüj. </li><li> Süpernatantı atın. 500 ul FACS tampon maddesi (PBS w / o Ca 2 + ve Mg2 +,% 5 FCS,% 0.05 sodyum azid) içinde süspanse hücreleri. </li><li> Hücresel floresan doğrulamak için analitik bir FACS kullanın. Negatif ve pozitif kontroller arasında bu için transfekte edilmiş hücrelerin floresans karşılaştır. </li><li> Transfekte hücreler kullanarak ilave olarak, flüoresan etiketli protein, tekrar adımları 3-26 ile hücreleri transfekte etmek için. </li><li> Floresans yüksek seviyeli Hücreler kullanılmalıdır. Arasında Optimal olarak, en azından% 50kültür hücreleri yüksek floresan olmalıdır. Hücre floresan FACS ile hücre sıralama artırılabilir. </li></ol> Her türlü ilave etiketli proteinlerin farklı fluorophores için sigortalı olmalıdır ve farklı bir seçim antibiyotikler için kodlama plazmid üzerinde kodlanmış. Birden fazla plazmid ile transfekte edilmiş hücreler için seçim ortamı tüm uygun antibiyotikler ile takviye edilmelidir. 2. T hücre Yayılma Testi Hazırlık <ol><li> Lab-Tek II Alman coverglass sistemi 4 oda slaytlar kullanın. Yanlışlıkla hazırlanması veya kullanım sırasında bir pipet ile örneğin odaları iç yüzeyi, sıfırdan değil emin olun. </li><li> 50-ml slayt hazırlama çözeltisi hazırlayın: 12 M (37%) HCl 4.6 ml alın, 38.5 ml% 100 etanol ve 6.9 ml iki kat distile su ekleyin. </li><li> 500 ul slayt hazırlık çözüm ile slayt her odası doldurun. </li><li> 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Odası aspires, tamamen kurutulması. </li><li> ° C kadar tamamen kuru 45 1 saat için ortaya çıkarılan slaytlar inkübe edin. </li><li> Iki kez damıtılmış su içinde% 0.1 poli-L-lisin (Sigma-Aldrich) seyreltilerek% 0.01 poli-L-lizin çözeltisi hazırlayın. </li><li> Her iki mecliste de 500 ul uygulayın. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika için slayt inkübe edin. </li><li> Tamamen kurutma, odaları aspire. </li><li> ° C kadar tamamen kuru 45 az 3 saat inkübe edin. </li><li> Kaplı slaytlar, oda sıcaklığında birkaç ay boyunca kuru saklanabilir. </li><li> Bir aktive edici antikor çözüm hazırlayın. HIT3a (BD Pharmingen # 555337) veya UCHT1 (BD Pharmingen # 555330), oda başına 400 ul PBS içinde 10 ug / ml ya da: bir anti-CD3 antikoru kullanın. Bu çözüm kısa bir süre slayt hazırlama önce hazırlanmalıdır. </li><li> Aktive edici antikor çözeltisi 400 ul her bir göze doldurulabilir. </li><li> Gece boyunca 4 °, tercihen 37 ° C veya daha, önceki 2 saat için slayt inkübe ° C. </li><li> Aktive antikor sol kaldırmaution ve hemen 300 ul PBS ile iki kez odasına yıkayın. Bu noktadan sonra, odaları tampon dolu kalır emin olun. </li><li> 4 ° C de PBS-dolu bir slayt Mağaza Biz 1 hafta içinde hazırlanan slayt odaları kullanmanızı öneririz. </li></ol> 3. T hücre aktivasyonu ve Görüntüleme <ol><li> [1,25 ml HEPES (1 M) ile, 10 mL FCS, 38.75 ml RPMI fenol kırmızısı olmadan] görüntüleme tamponu hazırlayın. Görüntüleme tampon 4 ° C&#39;de süzülerek saklanabilir. </li><li> Zeiss LSM 510 Meta mikroskop etkinleştirin. 37 için mikroskop ısıtılabilir montaj çerçevesi Sıcak ° C &quot;Uzman modu&quot; seçeneğini seçin. </li><li> &quot;Edinme&quot; sekmesine tıklayın ve aşağıdaki sekmeler açın: Lazerler, Mikroskopi, Yapılandırma, Tarama, Zaman Serisi. </li><li> Gerekli lazerler etkinleştirin. AÇSAP ağırlıklı ve mYFP, uyarma için daha sonra &quot;açık&quot; 5 dakika &quot;bekleme&quot; için Argon / 2 lazer, ayarlayın. </li><li> Aynı fluorophores kullanarak önce bu canlı hücre görüntüleme testi gerçekleştirdiyseniz, ortaya çıkan LSM dosyayı açmak, i &quot;yeniden&quot; tıklayıncon ve adım 9 yerden devam. Aksi takdirde adım 6 devam edin. </li><li> Kullanılan floresan proteinlerin uyarma ve emisyon için uygun filtreleri kullanarak kanalları tanımlayın. </li><li> &quot;Tarama kontrol&quot; penceresinde, Z yığını seçeneğini seçin. </li><li> 0.5 mikron; Şu dilim: 3;: dilim sayısı: Aralığı 5 aşağıdaki tarama parametreleri girin. </li><li> Mikroskop yakın 37 bir Accublock Dijital Kuru Banyo (Labnet) ° C hazırlayın. </li><li> 37 ° C&#39;ye ısıtın görüntüleme tampon </li><li> Sıcak görüntüleme tampon 600 ul ile değiştirilmesi, PBS aspire saklanan slayt hazırlayın. </li><li> 37 slayt inkübe ° C Adım 13 kadar, en az 15 dakika için inkübatör slayt tutun. </li><li> 5 toplayın x 10 5 transfekte edilmiş T hücreleri. </li><li> 400 × g 2 dakika hücreleri santrifüj. </li><li> Süpernatantı atın. </li><li> 1 ml sıcak görüntüleme tampon tekrar süspansiyon hücreleri ve 1.5 ml Eppendorf tüp aktarabilirsiniz. </li><li> T yerleştirinAccublock Dijital Kuru Bath ile ilgili est tüp. </li><li> Inkübatör ısıtılmış slayt alın ve ısıtılmış mikroskop montaj çerçevesi üzerine monte. </li><li> &quot;VIS&quot; simgesine tıklayın. </li><li> Hücre süspansiyonu karıştırın ve 1-2 ul çıkarın. </li><li> Slayt alt üzerinde görüntüleme tampona pipet ucu yerleştirin. Slayt çizilmesini önlemek. </li><li> Amacı en diyafram üzerinde tohum hücreleri. </li><li> Onlar iner gibi hemen görsel floresan hücreleri izlemeye başlar. Iki kanal yüksek floresan görüntüleyen bir hücre seçin. </li><li> Hücre slayt yüzeyine ulaşmadan önce, LSM modunu etkinleştirin. </li><li> Sadece bir uyarma lazer geçiş. Bir DIC kanal sahip olduğunuz bir lazer seçin. </li><li> 1 Zoom ayarlayın. &quot;Hızlı XY&quot; simgesine tıklayın. &quot;Dur&quot; simgesine tıklayın. Kırpma aracını kullanarak, hücre merkezli bir yatırım getirisi seçin. </li><li> 3 Zoom ayarlayın. &quot;Hızlı XY&quot; simgesini tıklatın, sonra el en iyi şekilde hücre görmek için odağı ayarlayın. &quot;Dur&quot; ico tıklayınn. </li><li> Tüm gerekli uyarma lazerler geçiş. </li><li> &quot;StartT&quot; ikonuna tıklayarak kayıt başlayın. Resim yayılma süreci (genellikle 5 dakika) bütünlüğü için hücre. Bittiğinde, &quot;Dur&quot; simgesini tıklatın. </li><li> Dosyayı kaydedin. </li><li> Ek hücreleri elde etmek için, &quot;VIS&quot; simgesini tıklatın. Henüz slayt alt temas gelmedi hücre varsa, adım 23 devam. Zaten yayılma süreci başladı görüntüleme hücreleri kaçının. Aksi halde 32 adıma geçin. </li><li> Gözlemlenen slayt alan hücreler çoğunlukla yoksun ise, hücreler (adım 20 ile devam edin) başka bir kısım ekleyin. Aksi halde 33 adıma geçin. </li><li> Ek hücreler elde etmek için, objektif en açıklık üzerindeki alana hücrelerinden yoksun olduğunu kaydırmak. </li><li> Hücreleri (ve adım 20 ile devam eder) bir başka kısım ekleyin. </li><li> Tüm istenen görüntüleme yaptıktan sonra, kaydedilmiş bir EKK dosyasını açın. </li><li> &quot;Galeri&quot;, &quot;Zaman + Z&quot; ve &quot;alt kümesi&quot; tıklayın. </li><li> Relevan seçint zaman aralığı ve Z yığını. </li><li> Yeni dosyayı kaydedin. </li><li> Tüm görüntüleme dosyalar için adımları 35-38 gerçekleştirin. </li></ol> 4. Görüntüleme Veri Analizi <ol><li> Imaris yazılım (Bitplane AG, Zürih İsviçre) kullanarak LSM dosyaları açın. </li><li> &quot;Aşan&quot; tıklayın. &quot;Görüntü İşleme&quot; menüsüne tıklayın ve &quot;Zaman ve Z Swap&quot; seçin. Bu, görüntünün doğru kırpma yardımcı olacaktır. </li><li> &quot;Düzenle&quot; araç çubuğu tıklayın ve açılan menüde &quot;Kes 3D&quot; seçeneğini seçin. Hücre çevresindeki sadece alanı bulunmaktadır görüntü kırpın. Biz hücre merkezli bir 300 × 300 piksel kare kırpma öneririz. Hücresinin şekli ve yeri zamanla değişebilir unutmayın. T ekseni Gözlem, hücre her zaman noktalarında kırpılmış bölge içinde olduğundan emin olun. </li><li> &quot;Görüntü İşleme&quot; menüsüne tıklayın ve resmin orijinal zamansal ayrılık geri yüklemek için &quot;Zaman ve Z Swap&quot; seçin. </li><li> Ana araç çubuğunda &quot;COLOC&quot; düğmesine basın. &quot;De Zaman Yapı seçins. COLOC &quot;. Imaris otomatik olarak her zaman noktasında her kanal için yoğunluk eşik hesaplar. </li><li> &quot;Kanal İstatistik&quot; seçerek ko analiz sonuçlarını görüntülemek. &quot;İhracat&quot; tıklayarak veri verir. </li><li> Her görüntülü hücre için 6 Adım 1 tekrarlayın. Biz en az 50 hücre bu şekilde analiz edilmesi önerilir. </li><li> Ortalama Pearson ko katsayısı ve standart hata veya sapma hesaplayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Viret, C., Janeway, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+and+T+cell+development.">MHC and T cell development.</a> Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).</li><li>Risso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+antimicrobial+peptides:+multifunctional+effector+molecules+of+innate+immunity.">Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity.</a> J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).</li><li>Doherty, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+cell+effector+and+memory+function+in+viral+immunity.">Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 206, 1-14 (1996).</li><li>Jager, D., Jager, E., Knuth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+tumour+antigens:+implications+for+antigen+specific+immunotherapy+of+cancer.">Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer.</a> J. Clin. Pathol. 54, 669-674 (2001).</li><li>Davis, M. M., Bjorkman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+antigen+receptor+genes+and+T-cell+recognition.">T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition.</a> Nature. 334, 395-402 (1988).</li><li>Burkhardt, J. K., Carrizosa, E., Shaffer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+cytoskeleton+in+T+cell+activation.">The actin cytoskeleton in T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).</li><li>Reicher, B., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+pathways+leading+from+the+T-cell+antigen+receptor+to+the+actin+cytoskeleton+network.">Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network.</a> FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).</li><li>Barda-Saad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+molecular+interactions+linking+the+T+cell+antigen+receptor+to+the+actin+cytoskeleton.">Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton.</a> Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).</li><li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+actin+polymerization+drives+T+cell+receptor-induced+spreading:+a+role+for+the+signal+transduction+adaptor+LAT.">Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT.</a> Immunity. 14, 315-329 (2001).</li><li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action.">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296, 913-916 (2002).</li><li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+colocalization+by+correlation:+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander's+overlap+coefficient.">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient.</a> Cytometry A. 77, 733-742 (2010).</li><li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells.">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).</li><li>Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosines+113,+128,+and+145+of+SLP-76+are+required+for+optimal+augmentation+of+NFAT+promoter+activity.">Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity.</a> J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).</li><li>Wunderlich, L., Farag&#243;, A., Downward, J., Buday, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Nck+with+tyrosine-phosphorylated+SLP-76+in+activated+T+lymphocytes.">Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes.</a> Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).</li><li>Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cooperation+between+the+proteins+Nck+and+ADAP+is+fundamental+for+actin+reorganization.">Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization.</a> Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).</li><li>Barda-Saad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+interactions+at+the+SLP-76+complex+are+critical+for+actin+polymerization.">Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization.</a> EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).</li><li>Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3 (2012).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir çıkar çatışması var.

Çoklu hücresel süreçlerin düzenlenmesi ve fonksiyonu protein-protein etkileşimleri oluşumu ve sonlandırma bağlıdır. Mikroskobik görüntüleme canlı hücrelerde floresan etiketli proteinlerin gerçek zamanlı izleme sağlar. Işaretlenmiş olan proteinlerin ko proteinler arasında doğrudan veya dolaylı olarak etkileşime önerebilir ve bu immüno-çökeltme gibi biyokimyasal yöntemler ile elde edilen bulguların güçlendirmek için kullanılabilir. Biyokimyasal yöntemler farklı olarak, canlı hücre görüntüleme bu arası protein etkileşimleri ortaya gibi fizyolojik süreçlerin izlenmesi kolaylaştırmak ve proteinlerin hücresel dağılımının saptanması, uzaysal ve bu süre boyunca gözlem sağlar. Ko kantitatif analiz için çeşitli araçlar geliştirilmiştir; Pearson korelasyon katsayısı iki protein 12 arasındaki ko derecesi ölçümü için çok çekici ve yaygın olarak kullanılan yöntem olmaya devam etmektedir. Da floresan rezonans Energy transferi (FRET) deneyleri yakın (10 nm) ile karakterize arası protein etkileşimleri tespiti sağlamak, bu yöntem özel ayarları (kullanılan floresan etiketlemeleri ekipman ve uyumluluk) ve karmaşık bilgi işlem gerektirir. Çoğu kullanım, ko analizi için, biyokimyasal yöntemler ile birleşik olarak, bir kolay kullanımlı için teşkil eder ve zaman içinde protein-protein etkileşimleri gözlemlemek için basit bir yöntem. Ya kanal için yoğunluğu eşiğin altına piksel görmezden, analiz piksel için bir floresan yoğunluklu eşik kurulması doğru ve hassas ko analiz için kritik önem taşımaktadır. Bu eşik amacı ve otomatik belirlenmesi için yaygın olarak kullanılan algoritma 13. Costes ve arkadaşları tarafından geliştirilen ve bu Imaris ve Volocity gibi görüntü işleme programları tarafından yürütülmektedir. Burada, canlı T-hücresi görüntüleme bölgesinin kullanımını göstermekSLP76 dinamiklerini analiz etmek için metodunu, önemli bir T-hücrelerinde, iskele ve Nck, bir adaptör protein, her ikisi de T-hücresi aktivasyonu için gerekli olan 14,15. Etkinleştirme sırasında toplanan T hücrelerinin Görüntüleri iki protein (Şekil 3), hücresel aktivasyon sürecinde kolokalize olduğunu göstermektedir. Bu nicel etkinleştirme işlemi boyunca toplanan görüntülerde Pearson ko testi pekiştirilmiştir. -1 -1 Bir puan anti-korelasyon anlamına gelir 1, için Pearson ko katsayıları aralığı, 1 puan mükemmel ko ve 0 anlamına gelir iki görüntü kanallar arasında bir ilişki anlamına gelir. Farklı zaman noktaları için ve farklı hücreler için hesaplanan Pearson ko katsayılarının karşılaştırılması Nck ve SLP76 bu ko önemli hücresel aktivasyonu sırasında değişmez gösterir, ancak (p&gt; 0.3, Şekil 4) sabit kalır. Da genel ko eşBu proteinlerin verimli aktivasyon süreci boyunca değişmez, bu dernek ve bu proteinlerin 18 arasında meydana gelen ayrışma dinamik bir süreç olasılığını ortadan kaldırmaz. Biz sunulan protokol de gerekir, gibi hücre büyüme koşullarının ayarlanması, söz konusu hücre çizgisi bir transfeksiyon için uygun ayar seçilmesi ve eğer varsa, hücresel aktivasyon işlemi değiştirerek diğer hematopoietik hücre hatları için adapte edilebilir. Biz uygun ayarların kullanımı ile, LSM 510 Meta konfokal mikroskop kullandı, diğer konfokal mikroskopi sistemleri başarıyla de kullanılabilir lütfen unutmayın. Canlı T hücre görüntüleme kullanımı biyokimyasal ve moleküler yöntemler kullanılarak zamansal ve mekansal çözünürlükte kullanılamaz ile keşfedilmeyi sinyal olaylar sağlayan, düzenleyici ve aktivasyon işlemleri doğrudan takip edilmesine olanak sağlamaktadır. Biz basit bir meth mevcut, canlı bir T hücre yayılan deneyi yürüten gerçek zamanlı olarak ilgili proteinler izleme ve nicel sonuçlar için verileri analiz için od. Sonuç mikroskobu veriler de bu tür hücre-şekil indeksi analizi gibi diğer downstream uygulamalar, 16 için kullanılan ve özel deney düzeneği ve araştırma amacına göre, analiz 17,18 FRET edilebilir.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa human T Cell nucleofector kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VCA-1002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti CD3 (UCHT1 clone)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300432</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon FACS Tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352058</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30160.03</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>345810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German coverglass system 4 chamber slides</td>
			<td>Lab-Tek II</td>
			<td>155382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Bio Lab</td>
			<td>8410501</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-025-1B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ALX-380-306</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine 0.1% (w/v) in H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accublock digital dry bath</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>D1105A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 510 Meta</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatable mounting frame - Heating Insert P S</td>
			<td>PeCon</td>
			<td>130-800-031</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempModule S (required for the heatable mounting frame)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>411860-9010-000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation device</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>Nucleofector I</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence activated cell sorter</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>FACSVantage SE</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>7.0.0</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time live imaging of t-cell signaling complex formation

Bulaşıcı hastalıklara karşı koruma bağışıklık sistemi 1,2 aracılık eder. T lenfositleri birden fazla bağışıklık hücrelerinin 3,4 aktivasyonu ve yanıtları düzenleyen, bağışıklık sisteminin ana koordinatör vardır. T-hücresi aktivasyonu antijen sunan hücreler (APC) tarafından gösterilen spesifik antijen tanınması bağlıdır. T-hücresi antijen reseptörü (TCR), her T-hücresi klonu özgüdür ve antijen özgüllüğü 5 belirler. Antijene TCR bağlayıcı TCR kompleksinin bileşenlerinin fosforilasyonu neden olur. T-hücresi aktivasyonunu teşvik etmek için, bu sinyali gibi TCR proteinlerin sinyal alımı gibi çeşitli önemli tepkiler başlatarak, zardan sitoplazma ve çekirdeğe transduse olmalıdır, APC Alanı (bağışıklık sinaps), molekül aktivasyonu, sitoskeletal düzenlenmesi, hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun yükselmesi ve gen ekspresyonu 6,7 değişiklikler. Doğruaktive sinyallerin itiation ve sonlandırılması uygun T hücre yanıtları için çok önemlidir. Sinyal proteinlerinin aktivitesi protein-protein etkileşimleri oluşumu ve sonlandırma bağlıdır, bu tür protein fosforilasyonu, protein kompleksleri, ve protein ubiquitylation çeşitli hücresel sitelerinin 8 proteinlerin işe oluşumu gibi translasyon sonrası modifikasyonlar. T-hücre aktivasyonu sürecinin iç işleyişini anlamak immünolojik araştırma ve klinik uygulamaları için çok önemlidir. Çeşitli testler protein-protein etkileşimleri araştırmak için geliştirilmiştir, ancak bu yaygın olarak kullanılan ortak immunoprecipitation yöntemi olarak biyokimyasal testleri, böylece hücresel dinamikleri içine değerli bilgiler gözlem engelleyen, protein konumu ayırt izin yok mekanizmaları. Ayrıca, bu toplu testlerin genellikle t farklı aşamalarında olabilir birçok farklı hücrelerden protein birleştirmeko hücresel süreci incelenmiştir. Bu zamansal çözünürlüğe üzerinde zararlı etkisi olabilir. Canlı hücrelerin gerçek zamanlı görüntülemenin kullanımı dolayısıyla sürecin 9,10 dinamikleri üzerinde ışık tutan, proteinlerin mekansal izleme ve geçici olarak sinyal olayları birbirinden ayırt etmek yeteneği hem de sağlar. Biz T-hücre aktivasyonu sırasında sinyal-kompleks oluşumunun gerçek zamanlı görüntüleme bir yöntem mevcut. Primer T-hücreleri veya bu gibi Jurkat T-hücre, fizyolojik olmayan bir oligomerizasyon 11 önlenmesi, monomer cinsi floresan proteinleri ile kaynaşmış ilgi proteinleri için kodlayan plazmid ile transfekte edilir. • Canlı hücreler, spesifik antijen için aktive ihtiyacının üstesinden gelinir ise T-hücresi aktivasyonunu uyaran, CD3/TCR kompleksine bağlanan T-hücresi aktive edici antikor 8,9, bir lamel ile önceden kaplanmış üzerinde bırakılır. Aktif hücreleri sürekli konfokal mikroskopi kullanımı ile görüntülü. Görüntüleme veriler, col gibi kantitatif sonuçlar, verim için analiz edilirsinyal proteinlerinin ocalization katsayısı.

Biz canlı T-hücre görüntüleme ve analiz bir örnek sunuyoruz. Görüntüleme deney öncesinde, SLP76 eksikliği T hücreleri (J14) floresan protein (Şekil 1) ifadesinin saptanması için FACS kullanımı ile analiz edilmiştir. Etiketli sinyal proteinleri AÇSAP ağırlıklı-Nck ve SLP76-mYFP ile transfekte T hücreleri aktive slaytlar üzerinde biriken ve T-hücre yayılan (Şekil 2) sırasında görüntülendi. Toplanan görüntüleri aktivasyon ve (Şekil 3) yayılan boyunca protein yerelleştirme dinamiklerini göstermektedir. Insan önyargı en aza indirirken bilgisayarlı görüntü işleme, yeni anlayışlar ve görsel hücrelerden kantitatif bilgi sağlar. Hücresel aktivasyon sürecinde iki proteinin ko incelemek için, Imaris yazılımı (Bitplane AG, Zürich İsviçre) ko aleti kullanılmaktadır. Görüntülü hücreler boyunca farklı zaman noktaları arasında ko katsayıları karşılaştırarak, biz<html> Nck ve SLP76 en ko T-hücre aktivasyonu (p&gt; 0.3) (Şekil 4) boyunca önemli bir değişiklik olmadığını tespit etmek mümkün. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50076/50076fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50076/50076fig1.jpg" /> Şekil 1. (B) mYFP,,. Hücrelerinin FACS analizi çift veri (A) &#39;AÇSAP ağırlıklı için floresan yoğunluğu histogramlar olarak gösterilmiştir floresan-etiketli proteinleri ile transfekte edilmiş ve (C), bir nokta arsa olarak. AÇSAP ağırlıklı-Nck ve SLP76-mYFP ile transfekte J14 hücrelerin floresan sırasıyla, kırmızı ve sarı temsil edilmektedir. Untransfected J14 negatif kontrol hücreleri siyah çizgiler ile gösterilir. / Files/ftp_upload/50076/50076fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. Canlı bir şematik T hücre analizi yayılan (A) T hücre aktive slaytların hazırlanması;. (B) T hücre yayılan tahlil ve analiz yaşıyor;. (C) mikroskopi kurulum <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50076/50076fig2large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50076/50076fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50076/50076fig3.jpg" /> Şekil 3,. AÇSAP ağırlıklı-Nck ve SLP76-mYFP eksprese eden bir T-hücresi aktivasyonu işlemi sırasında Nck ve SLP76 dağılımı. Hücreler, anti-CD3 antikoru uyarıcı önceden kaplanmış lameller üzerinde bırakılan ve sürekli olarak 7 dakikalık bir süre için görüntülendi. SLP76-mYFP sarı gösterilir ise AÇSAP ağırlıklı-Nck, mavi ile temsil edilir. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;her zaman&quot;&gt; <img alt="Şekil 4," fo:content-width="4.4in" fo:src="/files/ftp_upload/50076/50076fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50076/50076fig4.jpg" /> Şekil 4. Protein ko kantitatif analizi. Hücrelerin Görüntü işleme Imaris yazılım (Bitplane AG, Zürih İsviçre) kullanılarak yapıldı. Ko AÇSAP ağırlıklı kanalın yoğunluğu ve her piksel için mYFP kanal arasında Pearson korelasyon katsayısı olarak hesaplanır. Farklı zaman noktalarında hesaplanan Pearson ko katsayıları karşılaştırılmıştır. Otuz saniye aktivasyon sürecine, AÇSAP ağırlıklı-Nck ve SLP76-mYFP en ko katsayısı (p &lt;0.05) önemli ölçüde artmıştır. Bu sonuçlar,&gt; 50 bağımsız hücreler analiz ile hesaplanmıştır. Ortalama ± standart hata gösterilir.

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation at JoVE.com

T Hücresi Sinyal Kompleksi Oluşumunun Gerçek Zamanlı Canlı Görüntülenmesi | İmmünoloji ve Enfeksiyon | Video

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Biz T-hücre aktivasyonu işlemi sırasında protein dinamiği içgörü sağlayan bir canlı hücre görüntüleme yöntem açıklanmaktadır. Bu kantitatif sonuçlar T-hücresi aktivasyonu boyunca kompleks oluşumu sinyalizasyon takip vermek üzere T-hücresi yayılmasını tahlilinde, konfokal mikroskopi ve görüntü analizi, kombine kullanımını göstermektedir.

T hücre gerçek zamanlı Canlı Görüntüleme Kompleks Oluşum Sinyal

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

real-time-live-imaging-of-t-cell-signaling-complex-formation

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Cellular Processes

Cell Signaling

SCIENTISTS IN ACTION

13.6K Görüntüleme.  Bar-Ilan University. Biz T-hücre aktivasyonu işlemi sırasında protein dinamiği içgörü sağlayan bir canlı hücre görüntüleme yöntem açıklanmaktadır. Bu kantitatif sonuçlar T-hücresi aktivasyonu boyunca kompleks oluşumu sinyalizasyon takip vermek üzere T-hücresi yayılmasını tahlilinde, konfokal mikroskopi ve görüntü analizi, kombine kullanımını göstermektedir.

Video: Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to intracellular responses. GPCRs control diverse biological functions such as chemotaxis, intracellular calcium release, gene regulation in a ligand dependent manner via heterotrimeric G-proteins1-2. Ligand binding induces a series of conformational changes leading to activation of heterotrimeric G-proteins that modulate levels of second messengers such as cyclic adenosine monophosphate (cAMP), inositol triphosphate (IP3) and diacyl glycerol (DG). Concomitant with activation of the receptor ligand binding also initiates a series of events to attenuate the receptor signaling via desensitization, sequestration and/or internalization. The desensitization process of GPCRs occurs via receptor phosphorylation by G-protein receptor kinases (GRKs) and subsequent binding of &beta;-arrestins3. &beta;-arrestins are cytosolic proteins and translocate to membrane upon GPCR activation, binding to phosphorylated receptors (most cases) there by facilitating receptor internalization 4-6.
Leukotriene B4 (LTB4) is a pro-inflammatory lipid molecule derived from arachidonic acid pathway and mediates its actions via GPCRs, LTB4 receptor 1 (BLT1; a high affinity receptor) and LTB4 receptor 2 (BLT2; a low affinity receptor)7-9. The LTB4-BLT1 pathway has been shown to be critical in several inflammatory diseases including, asthma, arthritis and atherosclerosis10-17. The current paper describes the methodologies developed to monitor LTB4-induced leukocyte migration and the interactions of BLT1 with &beta;-arrestin and , receptor translocation in live cells using microscopy imaging techniques18-19.
Bone marrow derived dendritic cells from C57BL/6 mice were isolated and cultured as previously described 20-21. These cells were tested in live cell imaging methods to demonstrate LTB4 induced cell migration. The human BLT1 was tagged with red fluorescent protein (BLT1-RFP) at C-terminus and &beta;-arrestin1 tagged with green fluorescent protein (&beta;-arr-GFP) and transfected the both plasmids into Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) cell lines18-19. The kinetics of interaction between these proteins and localization were monitored using live cell video microscopy. The methodologies in the current paper describe the use of microscopic techniques to investigate the functional responses of G-protein coupled receptors in live cells. The current paper also describes the use of Metamorph software to quantify the fluorescence intensities to determine the kinetics of receptor and cytosolic protein interactions.

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &#946;-arrestin

This paper describes the methodology to determine the chemotactic response of leukocytes to specific ligands and identify interactions between the cell surface receptors and cytosolic proteins using live cell imaging techniques.

Lökotrien B Gerçek zamanlı görüntüleme 4 Hücre aracılığı ile Göç ve β-arrestin BLT1 Etkileşimleri

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

Canlı Fare Damar İltihabı ve trombüs oluşumu sırasında Activated Endotel üzerinde heterotypic Trombosit nötrofil Etkileşimleri Gerçek zamanlı Görüntüleme

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

Nötrofil Hicret altında Fizyolojik Akış sırasında endotel hücre-hücre Eklemlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Miyeloid hücrelerin Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme<em&gt; Süm<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Bağırsak Tümörleri Disk Eşodaklı Mikroskopi Spinning tarafından

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/106 cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.

T-hücre reseptörleri Eksizyon Circles Eşzamanlı Niceleme (TREC) ve K-silme Rekombinasyon Eksizyon Circles (KRECs) Gerçek zamanlı PCR ile

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions.&#160;The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model.&#160;In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an&#160;in vivo&#160;model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

Görüntüleme Patogenez ve Cording Deşifre ve<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Zebra balığı Embriyolar

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Iltihaplı Dermisinde içinde görüntüleme CD4 + T hücre Geçiş Göç

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal of immunosuppression. The mixed leukocyte reaction (MLR), limiting dilution assays, and trans-vivo delayed-type hypersensitivity (DTH) assay have all been applied to this question, but these methods have limited predictive ability and/or significant practical limitations that reduce their usefulness. Imaging flow cytometry is a technique that combines the multiparametric quantitative powers of flow cytometry with the imaging capabilities of fluorescent microscopy. We recently made use of an imaging flow cytometry approach to define the proportion of recipient T cells capable of forming mature immune synapses with donor antigen-presenting cells (APCs). Using a well-characterized mouse heart transplant model, we have shown that the frequency of in vitro immune synapses among T-APC membrane contact events strongly predicted allograft outcome in rejection, tolerance, and a situation where transplant survival depends on induced regulatory T cells. The frequency of T-APC contacts increased with T cells from mice during acute rejection and decreased with T cells from mice rendered unresponsive to alloantigen. The addition of regulatory T cells to the in vitro system reduced prolonged T-APC contacts. Critically, this effect was also seen with human polyclonally expanded, naturally occurring regulatory T cells, which are known to control the rejection of human tissues in humanized mouse models. Further development of this approach may allow for a deeper characterization of the alloreactive T-cell compartment in transplant recipients. In the future, further development and evaluation of this method using human cells may form the basis for assays used to select patients for immunosuppression minimization, and it can be used to measure the impact of tolerogenic therapies in the clinic.

This paper describes a method for measuring alloreactivity in a mixed population of T cells using imaging flow cytometry.

Görüntüleme Akım Sitometri Kullanımı T Hücresi alloreaktivitesini Ölçümü

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...