Yazarlar, bize lenf nodu dilim gerçekleştirmek için teşvik Dr. Alain Trautmann&#39;ın teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Ligue Nationale Contre le Kanser, Fondation pour la Recherche medicale en France ve Ortaklık pour la recherche sur le Kanser hibe kısmen desteklenmiştir.

1. Lenf düğümleri hazırlanması dilimleri <ol><li> Gömmek için% 4, düşük erime noktası agaroz çözüm hazırlayın. PBS ve mikrodalga bu çözüm agaroz sulandırınız. Agaroz tamamen çözülür, çözüm ° C hazır olana kadar kullanılmak üzere 37 korur. </li><li> 6-iyi doku kültürü tabak hazırlayın. 1.1 ml RPMI tam bir kültür ortamı iyi ortalama ekleyin ve her iyi bir Organotipik filtre takın. 6-plaka, 4 ° C dilim aktarmak için hazır olana kadar yerleştirin. </li><li> RPMI tam orta ile dolu plastik bir tabak içine iç çapı 4 mm, paslanmaz çelik pullar yerleştirin. Yıkayıcılar vibratome kesilmiş dilim hücreler daha fazla konsantre olacaktır. </li><li> Kurban, yerel hayvan refahı kurallarına uygun fare. Periferik lenf düğümleri çevreleyen doku dikkatlice çıkarın ve buz gibi soğuk PBS içeren bir plastik tabak koyun. Bu organların çok yumuşak Bakımı, lenf nodu yapısı zarar vermemek için alınmalıdır. </li><li> % 4-agaroz jel 35 mm plastik tabak içine dökün ve ince jel düğümleri aktarmak. Agaroz jel, 5 dakika sertleşmesine buz üzerinde bırakın. </li><li> Blok çanak çıkarın ve her bir lenf nodu etrafında 3-5 mm jel bırakmak için agar düzeltin. </li><li> Toksik olmayan doku yapıştırıcısı ile vibratome numune disk üzerinde gömülü düğümleri takın. Buz gibi soğuk PBS ile dolu tepsi numune diski takın. </li><li> Bölümde agar-gömülü yavaş bir dizi orta menzilli (1,5 mm) ayarlanmış vibratome hızı (0.3 mm / s) ve titreşim frekansı ile 320 mikron kalınlığında doku. </li><li> Dikkatlice lenf nodu dilimleri, ince forseps kullanarak Organotipik kültür ekler üzerine kesilmiş olarak aktarın. Her ekleme 3 dilimleri yerleştirin. Dilim kolayca zarar görebilir gibi büyük bir özen kullanın. 320 mikron kesildiğinde tipik bir periferik lenf nodu 5 bölümden verecektir. Onlar sadece yüzeysel doku içeren, ilk ve son dilim atın. </li><li> Her bir dilim paslanmaz çelik pullar yerleştirin. Pullar doku çevresindeki agaroz konumlandırılmış emin olun. </li><li> Inkübe kültür plaka 37 ° C,% 5 CO 2 nemlendirilmiş inkübatör plaka T hücreleri için hazır olana kadar . </li></ol> 2. T hücreleri fare lenf düğümleri Yalıtımlı <ol><li> Daha önce yayınlanmış vallahi Madde 3 göre T hücreleri izole edin. </li><li> T hücreleri hemen kullanın ve bir sonraki bölüme geçin. Aksi takdirde, lenfositler, 10 ng / ml, IL-7 ile desteklenmiş tam RPMI orta gecede kültüre olabilir. </li></ol> 3. Izole T hücreleri Etiketleme <ol><li> HBSS hücrelerin yıkayın. Ml&#39;de 10 x 10 6 aynı tampon onları tekrar </li><li> 0.5 mcM bir final konsantrasyon veren 1 mcM Hücre Tracker yeşil CMFDA içeren HBSS aynı hacimde ekleyin. </li><li> 5 dakika boyunca 37 ° C hücre süspansiyonu inkübe edin. RPMI-orta hücreler iki kez yıkayın. </li><li> RPMI-orta ml başına 10 x 10 6 son bir konsantrasyonda süspanse edin hücreleri. Bu etiketli hücreleri dilimleri üzerine kaplama olacak. </li></ol> CMFDA dışında floresan boyalar da kullanılır, ancak bu moleküllerin belirli konsantrasyonların üzerinde potansiyel olarak toksik olduğunu akılda tutmak olabilir. 4. Lenf nodu dilimleri üzerine Kaplama etiketli T hücreleri <ol><li> Bir pipet yardımıyla yıkama iç kısmında bulunan fazla orta çıkarın. Doku kuru hale izin vermeyin, bu adımı sırasında hızlı bir şekilde çalışma. </li><li> Yıkayıcı iç kısmında 1 2 x 10 5 hücre karşılık 10 20 ul etiketli T hücreleri hafifçe dağıtmak. Bakım pipet ucu ile doku dokunmamaya dikkat edilmelidir. Hücre süspansiyonu açılan yerde kalır emin olun. </li><li> 37 inkübatörde hücreleri ile dilimleri yerleştirin ° C ve% 5 CO 2 lenfositlerin dokuya göç etmelerine izin verilmesi için en az 30 dk. </li></ol> 5. T hücrelerinin lenf nodu dilimleri içinde Görüntüleme Bu video-makale, görüntü floresan T hücreleri widefield ters bir mikroskop ve konfokal dik bir mikroskop ile lenf nodu dilim. <ol><li> 37 ° sıcaklığı ayarlayın ° C Bizim mikroskoplar ısı kontrollü odaları ile donatılmıştır. </li><li> Oksijenli (% 5 CO 2,% 95 O 2) fenol red-free RPMI medyum ile lenf nodu dilim sürekli perfüzyon sağlayan bir perfüzyon sistemi kurun. Bizim sistemde, perfüze medya yerçekimi ile bir taraftan görüntüleme odasına girer. Orta bir atık toplama balonuna bağlı bir pompa ile aspire edilir. Medya akış hızı 1 ml / dk olarak ayarlayın. </li><li> Ince forseps ile 6-plaka, incelikle dilim almak ve doku içine sızmış floresan hücrelerinin kurtulmak için birkaç saniye boyunca ısınmış oksijenli RPMI orta hazırlık daldırma. </li></ol> ImaT hücreleri geniş bir alan inverted mikroskop ile ging <ol start="4"><li> Dilim bir bardak çanak alt iç kısmına yapıştırılmış naylon konuları oluşan bir ölçüye göre görüntüleme odasının baş aşağı yerleştirin. Bu odada, cam, naylon konuları dilim yükseltmek ve doku içine diffüz oksijenli çözüm sağlar. Lenf düğümleri T hücre göçü oksijen kuvvetle bağlı olarak bu gereklidir. Bunun üzerine bir paslanmaz çelik yıkayıcı ekleyerek dilim sabitleyin. Bu koşullarda, dilim perfüzyon çözüm yenileme kolaylaştırır çanak alt yukarıdaki birkaç mikron yatıyor. </li><li> Geniş bir görüş alanı (800 x 800 mm, düğümün dilim yüzeyinin yaklaşık üçte biri) yakalamak için, 10x kuru objektif lens kullanarak görüntü toplamak. Biz 10x Nikon S Florlu 0.5 NA analizler için en uygun olduğu bulundu. </li></ol> Tipik bir zaman atlamalı görüntüleme deney toplam derinliği 50 mm aksiyel (z) boyutta kapsayan 5 optik uçakları yakalar. Floresan T hücreleri genellikle 10 ila 20 dakika boyunca 10 ila 30 saniye arasında değişen aralıklarla görüntülenmiş. Görüntüleme konfokal dik bir mikroskop ile T hücreleri Bu protokolde kullanılan konfokal mikroskop 20x suya daldırma amacı (Olympus, 20x/0.95 NA) ile donatılmış bir Leica SP5. <ol start="6"><li> Mikroskop görüntüleme aşamasında dilim sabitleyin. Not: Biz genellikle hareketsiz hazırlık bir pul. </li><li> Z ekseni boyunca bir dizi görüntüleri toplayarak bir görüntüleme oturumu ayarlayın. Görüntü T hücreleri sağlam bir doku yapısı için, başlama pozisyonu genellikle ilk etiketli T hücre altında 5 ila 10 mikron olarak belirlenmiştir. </li></ol> 6. Temsilcisi sonuçları Bu video protokol takip ederek, çok sayıda floresan T hücrelerinin düğümün T bölgesi, normalde in vivo (Şekil 1) bu özel ortamda meydana gelen bir fenomen biriken görselleştirmek için beklemeliyiz . Özellikle, T hücreleri sadece kapsül altında genellikle B hücre bölgeleri, ekarte edilmelidir. Başarılı bir deney de sağlam lenf düğümleri 4 elde yayınlanan sonuçlar ile tutarlı bir (Şekil 3) son derece hareketli bir davranış gösteren, T hücrelerinin doku (Şekil 2) işe neden olacaktır. Dilimleri içinde bireysel T hücrelerinin ortalama hız, ortalama olarak, yaklaşık 10 mm / dak (Şekil 4) olmalıdır. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. T hücrelerinin lenf nodu dilim birikir. Floresan etiketli T hücreleri (CMFDA yeşil) görüntü elde etme önce bir lenf düğümü dilim 30 dakika (üst resim) ilave edildi. Z yönünde 50 mikron kapsayan 5 görüntülerin maksimum projeksiyon görüntü. Parlak bir alan görüntü, alt gösterilmiştir. Görüntüler bir widefield mikroskop ile ele geçirildi. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2. T hücrelerinin lenf nodu dilim içine alınırlar. Floresan etiketli T hücreleri (CMFDA yeşil) konfokal mikroskop kullanarak görüntü elde etme önce bir lenf düğümü dilim 30 dakika ilave edildi. Görüntüler Kesilen yüzey (üst resim) ve 40 mm (alt resim) ele geçirildi. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3. T hücrelerinin lenf nodu dilim içinde son derece hareketli. Floresan etiketli T hücreleri 12 dakika içinde bir widefield mikroskop kullanılarak görüntülenmiştir. Bireysel T hücrelerinin Yörüngeler mavi (düşük hareketli hücreler), kırmızı (yüksek hareketli hücreler) artan deplasmanları temsil etmek için renk kodlu parça olarak görüntülenir. Parçalar Imaris yazılımı kullanılarak hesaplandı. Kesik oval varsayılan B hücresi bölgesi sınırlar ise, beyaz bir çizgi, düğümün kenarına izler. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig4.jpg" alt="Şekil 4"/> Şekil 4 lenf nodu dilim içinde, T hücre hızı 10 mm / dak yakındır. Hızları Şekil 3&#39;te temsil parça Imaris yazılımı kullanılarak hesaplandı.

<ol>
	<li>Asperti-Boursin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-independent+manner.">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase-independent manner.</a> J Exp Med. 204, 1167-1167 (2007).</li><li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment.">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nat Immunol. 6, 143-143 (2005).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification.">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node.">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1869 (2002).</li><li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes.">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-986 (2009).</li><li>Gollmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL21+mediates+CD4++T-cell+costimulation+via+a+DOCK2/Rac-dependent+pathway.">CCL21 mediates CD4+ T-cell costimulation via a DOCK2/Rac-dependent pathway.</a> Blood. 114, 580-580 (2009).</li></ol>

Biz tanıtıldı T hücrelerinin davranışı araştırmak için kullanılır lenf nodu dilimleri, üretmek için basit, hızlı ve sağlam bir teknik tanımlanmıştır. Son yıllarda, bu yöntem başarılı bir şekilde kontrol eden T hücre konumlandırma ve motilite 1,5 ekstrasellüler faktörleri belirlemek için timus ve lenf nodu dilimleri kullanarak tatbik edilmiştir. Aynı zamanda pozitif seçim sırasında ve sonra T hücrelerinin antijen tanıma 2,6 timositleri Ca 2 + tepkileri ölçmek için kullanılır olmuştur. Bindirme dilim tahlil avantajları ve sınırlamalar ele alınacak hak sunar. Notu, bu sistemin moleküler hücre göç kontrolü ile müdahale edebilmek için bir ihtiyacı farmakolojik dilimleri işlemek için faydalı, doku erişim izni verir. Görüntülemeye sonra dilimleri görüntülü edilmiş yapılar hakkında daha fazla bilgi toplamak için immünohistokimya için işlenmiş olabilir. Ayrıca, gözlem, geleneksel bir widefield floresan mikroskobu ile yapılabilir. Çözünürlük konfokal veya iki foton bir mikroskop gibi iyi değil ve bu fototoksisite prensip olarak iki foton mikroskobu ile daha tek foton ile daha şiddetli olmasına rağmen, bu basitlik avantajlarını, daha düşük bir maliyetle ve daha büyük bir seçim var eksitasyon dalga boylarında. T hücreleri sağlam bir lenf nodu görüntüleme etiketli lenfositlerin intravenöz enjeksiyon gerektirir lenfoid organlara daha sonra ev. Biz daha önce 1 gösterdiği gibi, dilim tahlil, evlat edinen transferi deney ile mükemmel uyumlu . Ancak, T hücreleri lenf düğümleri içine ev için gerekli sürenin uzunluğu zamanla hücrelerin dışarı akması için bir eğilim var floresan boyaların kullanımı karmaşık hale getirebilir. Bu durumda Ca 2 + boya Fura-2. T hücrelerinin doku içine hızlı işe (&lt;30 dk), dilim testi bu tür boyalar kullanmak için bir fırsat sağlar. Son olarak, bu yöntem, birçok insan dokularında T hücre fonksiyonlarını analiz için büyük bir avantaj yaşatılıyor. Bu deneysel sistemi de göz önünde bulundurulması gereken kısıtlamalar sunar. Dilimleme ile ilişkili hasarlar, özellikle kesme yüzeyine yakın doku yüzeysel bir bölgede, T hücre işleyişini etkileyebilir. Dilim içinde hücre ölümünü değerlendirmek amacıyla, floresan boya SYTOX yeşil tehlikeye plazma zarı ile hücre nüfuz kullanmıştır. Deneyler, çoğunlukla yüzeysel doku bölgede lokalize toplam düğüm hücreleri, yaklaşık% 20 bu nükleer boya ile floresan etiketli olduğunu ortaya koymaktadır. Testi ile diğer potansiyel endişe kemokinler de dahil olmak üzere önemli çözünür faktörler korumak için dilim yeteneğidir. T hücreleri dilim içinde iyi bir motilite ekran yılından beri bu tür sorunlar etkilendiğini herhangi bir gösterge olsa da, biz görüntüleme T hücrelerinin sağlıklı bölgelerde kesim yüzeyi mikron onlarca bulunan önemini vurgulamak istiyorum. Bu protokolde gibi geleneksel mikroskoplar (widefield veya konfokal) ile yapılabilir Oysa, bu iki foton görüntüleme derinlemesine uzaysal çözünürlüğü artırmak ve fototoksisite azaltacaktır ile birlikte lenf nodu dilim hazırlık muhtemeldir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Konfokal mikroskop </td><td> Leica </td><td> SP5 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Leica </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Güzel Forseps </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 14142 </td><td></td></tr><tr><td> 30 mm Kültür ekler </td><td> Millipore </td><td> PICM0RG50 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 61870010 </td><td> Komple RPMI-orta,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu ve penisilin / streptomisin ekleyerek yapılır </td></tr><tr><td> Hanks &#39;Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14170088 </td><td></td></tr><tr><td> Düşük jelleşme sıcaklığı Agaroz, tip VII-A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> Butil Siyanoakrilat Tutkal, Vetbond </td><td> 3M </td><td> 1469 </td><td></td></tr><tr><td> Paslanmaz çelik pullar, iç çapı 4 mm </td><td> Yapı marketi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hücre Tracker yeşil CMFDA </td><td> Invitrogen </td><td> C7025 </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo imaging of t cells in murine lymph node slices with widefield and confocal microscopes

Nadir ifade antijenleri tespit etmek için periferik lenf düğümleri de dahil olmak üzere ikincil lenfoid organlara, naif T hücrelerinin sürekli trafik. T hücrelerinin lenf düğümleri içine göç kemokinler de dahil olmak üzere hem hücresel ve kimyasal faktörleri içeren karmaşık bir süreç. Son zamanlarda, iki foton mikroskopi sağlam lenf düğümleri T hücreleri izlemek için kendi davranış ve etkileşimleri ve diğer hücreleri ile bazı sayısal bilgiler elde etmek için izin verdi. In vivo sistemde bir açık avantajları olmakla birlikte, bu yaklaşım, karmaşık ve pahalı aletlerle gerektirir ve doku sınırlı erişim sağlar. Fare lenf düğümleri içinde T hücrelerinin davranışını analiz etmek, bir dilim testi 1, başlangıçta neurobiologists tarafından kurulan ve son zamanlarda fare timus 2 aktarılmamıştır geliştirdik. Bu teknikte, floresan etiketli T hücreleri, akut hazırlanan bir lenf nodu dilim üst kaplamadır. Bu video-makale, T hücrelerinin doku içine yerelleştirme ve göç widefield ve konfokal mikroskop ile gerçek zamanlı olarak analiz edilmektedir. In vivo olarak iki foton mikroskopi doğal ortamda görüntü T hücreleri etkili bir yaklaşım sunuyor ve T hücre göçün altında yatan mekanizmaları aydınlatmak için tamamlar tekniği.

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes at JoVE.com

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Bu protokol, lenf nodu dilimler halinde sunulan görüntü floresan T hücreleri için bir yöntem açıklanır. Bu teknik, geleneksel widefield floresan veya konfokal mikroskoplar ile T hücre göç gerçek zamanlı analiz izin verir.

Widefield ve Konfokal Mikroskoplar murin Lenf Düğümü Dilimleri T Hücre ex vivo Görüntüleme

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

ex-vivo-imaging-t-cells-murine-lymph-node-slices-with-widefield

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

16.7K Görüntüleme.  Université Paris Descartes, CNRS (UMR 8104). Bu protokol, lenf nodu dilimler halinde sunulan görüntü floresan T hücreleri için bir yöntem açıklanır. Bu teknik, geleneksel widefield floresan veya konfokal mikroskoplar ile T hücre göç gerçek zamanlı analiz izin verir.

Video: Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Kasık lenf düğüm intravital Mikroskopi

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

Mürin Yüzeysel lenf nodu Cerrahisi

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Intravital Görüntüleme Fare Popliteal Lenf Nodu

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

Lenf düğümü Stromal Hücre Menşe Çalışmaları Lenf-yağ Pad Kimeralar Üretimi

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Kemirgen Lenf Düğümü Stromal Hücrelerinin İzolasyonu

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Akut Beyin Dilimleri bir Oligodendrosit yönelik T-Hücre Saldırı Modeli

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes during initial entry and establishes a primary infection in the epithelium, which is followed by latent infection of neurons. After reactivation, viruses can become evident at mucocutaneous sites that appear as skin vesicles or mucosal ulcers. How HSV-1 invades skin or mucosa and reaches its receptors is poorly understood. To investigate the invasion route of HSV-1 into epidermal tissue at the cellular level, we established an ex vivo infection model of murine epidermis, which represents the site of primary and recurrent infection in skin. The assay includes the preparation of murine skin. The epidermis is separated from the dermis by dispase II treatment. After floating the epidermal sheets on virus-containing medium, the tissue is fixed and infection can be visualized at various times postinfection by staining infected cells with an antibody against the HSV-1 immediate early protein ICP0. ICP0-expressing cells can be observed in the basal keratinocyte layer already at 1.5 hr postinfection. With longer infection times, infected cells are detected in suprabasal layers, indicating that infection is not restricted to the basal keratinocytes, but the virus spreads to other layers in the tissue. Using epidermal sheets of various mouse models, the infection protocol allows determining the involvement of cellular components that contribute to HSV-1 invasion into tissue. In addition, the assay is suitable to test inhibitors in tissue that interfere with the initial entry steps, cell-to-cell spread and virus production. Here, we describe the ex vivo infection protocol in detail and present our results using nectin-1- or HVEM-deficient mice.

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.

Herpes Simplex virüs tip 1 ile murin Epidermis Ex ​​vivo enfeksiyon

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&amp;#948;1+CD4+&amp;#947;&amp;#948; T Cells, an Extrathymic &amp;#945;&amp;#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

İzolasyon ve<em&gt; Ex Vivo</emVδ1 of&gt; Kültür<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T hücrelerinin bir Extrathymic αβT hücre Progenitör

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte cell culture and 64Cu-antibody receptor targeting of the cells. In vitro evaluation of the radiolabel and non-invasive in vivo cell tracking in an animal model of an airway delayed-type hypersensitivity reaction (DTHR) by PET/CT are described.
In detail, the conjugation of a mAb with the chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) is shown. Following the production of radioactive 64Cu, radiolabeling of the DOTA-conjugated mAb is described. Next, the expansion of chicken ovalbumin (cOVA)-specific CD4+ interferon (IFN)-&#947;-producing T helper cells (cOVA-TH1) and the subsequent radiolabeling of the cOVA-TH1 cells are depicted. Various in vitro techniques are presented to evaluate the effects of 64Cu-radiolabeling on the cells, such as the determination of cell viability by trypan blue exclusion, the staining for apoptosis with Annexin V for flow cytometry, and the assessment of functionality by IFN-&#947; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, the determination of the radioactive uptake into the cells and the labeling stability are described in detail. This protocol further describes how to perform cell tracking studies in an animal model for an airway DTHR and, therefore, the induction of cOVA-induced acute airway DHTR in BALB/c mice is included. Finally, a robust PET/CT workflow including image acquisition, reconstruction, and analysis is presented.
The 64Cu-antibody receptor targeting approach with subsequent receptor internalization provides high specificity and stability, reduced cellular toxicity, and low efflux rates compared to common PET-tracers for cell labeling, e.g.64Cu-pyruvaldehyde bis(N4-methylthiosemicarbazone) (64Cu-PTSM). Finally, our approach enables non-invasive in vivo cell tracking by PET/CT with an optimal signal-to-background ratio for 48 h. This experimental approach can be transferred to different animal models and cell types with membrane-bound receptors that are internalized.

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Following the preparation of a 64Cu-modified monoclonal antibody binding to a transgenic murine T cell receptor, T cells are radiolabeled in vivo, analyzed for viability, functionality, labeling stability and apoptosis, and adoptively transferred into mice with an airway delayed-type hypersensitivity reaction for non-invasive imaging by positron emission tomography/computed tomography (PET/CT).

tarafından Kemirgen Lenfosit Etiketleme<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antikor Reseptör için hedefleme<em&gt; In Vivo</em&gt; PET / CT ile hücre Trafik

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...