Hücresiz protein sentezi, proteinlerin in vitro üretimi için sistemlerde ve sentetik biyolojide gelişen bir teknolojidir. Hücresiz protein sentez sistemlerinin hücre duvarı yoktur, bu nedenle metabolitlere doğrudan erişebiliyoruz. Bu protokolde, merkezi karbon ve enerji metabolizmasında yer alan 40 metabolitin mutlak ölçümlerini ölçeriz, bu da hücresiz metabolizmayı karakterize etmemizi sağlar.
Protokol, bileşiklerin aniline metastaz yapmasına dayanır, bu da daha iyi ayırma ve daha yüksek kütle spektrometresi çözünürlüğü sağlar. Buna ek olarak, metabolitlerin mutlak niceliği için aniline etiketli bir izotopik ile iç standartları kullanırız. Etiketli metabolitleri coelute, hangi demir bastırma etkilerini ortadan kaldırır.
Bileşiklerin doğru niceliklenmesine izin verir. Bir başlık çalışma, anipin 550 mikrolitre birleştirmek, LC-MS sınıf su 337.5 mikrolitre ile. Ve 112.5 mikrolitre 12 molar hidroklorik asit bir santrifüj tüpünde.
Girdap iyi, ve pH 4.5 ve dört derece santigrat altı azı lı aniline çözeltisi saklayın. Altı molar karbon-13 aniline çözeltisi hazırlamak için, pH 4.5, karbon-13 aniline 250 miligram su 132 mikrolitre ve 12 molar hidroklorik asit 44 mikrolitre birleştirir. Girdap iyi, ve dört santigrat derecede saklayın.
Mililitre EDC çözeltisi başına 200 miligram hazırlamak için, etiketlenecek her numune için 10 mikrolitre suda iki miligram EDC çözün. Ve girdap iyi. Numunehazırlamak için, hücre içermeyen protein sentezreaksiyonundaki proteinleri söndürün ve çökeltin, hücresiz sentez reaksiyonuna eşit hacimde buz soğuğu %100 etanol ekleyerek.
Numuneyi 12,000 kez g,4 derecede 15 dakika santrifüj edin. Numunenin süpernatantını yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Numuneyi karbon-12 anifin çözeltisi ile etiketlemek için, numunenin altı mikrolitresini yeni bir santrifüj tüpüne aktarın ve hacmi suyla birlikte 50 mikrolitreye getirin.
Mililitre EDC çözeltisi başına 200 miligram 5 mikrolitre ekleyin, karbon-12 aniline çözeltisini iyice karıştırın ve tüpe 5 mikrolitre aktarın. Oda sıcaklığında iki saat boyunca hafifçe sallayarak reaksiyon girdap. İki saat sonra, shaker tüpleri çıkarın ve bir duman başlık içine aktarın.
Anilin etiketleme reaksiyonu durdurmak ve bileşikleri stabilize etmek için her reaksiyona 1,5 mikrolitre triethylamamin ekleyin. Santrifüj 13, 500 kez g üç dakika. Ve süpernatant'ı kurtar.
İç standartları karbon-13 aninin çözeltisi ile etiketlemek için, iç stok çözeltisini son hacmi 50 mikrolitre olan 80 mikromuza seyreltin. Mililitre EDC çözeltisi başına 200 miligram beş mikrolitre ve iyi karıştırılmış karbon-13 aniline çözeltisinin beş mikrolitresini ekleyin. Oda sıcaklığında iki saat boyunca hafifçe sallayarak reaksiyon girdap.
İki saat sonra, shaker tüpleri çıkarın ve bir duman kaputunda reaksiyona triethylamamin 1.5 mikrolitre ekleyin. Santrifüj 13, 500 kez g üç dakika ve supernatant kaydedin. Etiketli dahili standardı ve etiketli örneği ilâhetmek için, her birinin 25 mikrolitresini bir otoörnekleyici şişede karıştırın.
Ve LC-MS prosedürü ile analiz edin. Daha sonra, etiketlenmemiş metabolitler için standart bir eğri oluşturmak için, ilk olarak, 50 mikrolitre hacmi ile, farklı konsantrasyonlarda etiketsiz metabolitlerin stok çözeltisi seyreltmek. Her konsantrasyona mililitre EDC çözeltisi başına 200 miligram lık beş mikrolitre ve beş mikrolitre karbon-12 aniline çözeltisi ekleyin.
Oda sıcaklığında iki saat boyunca hafifçe sallayarak reaksiyon girdap. Ve trietitamin tedavisine devam edin. Ve daha önce olduğu gibi LC-MS tarafından analiz önce santrifüj.
LC-MS'yi aldıktan sonra, üreticinin talimatlarına göre, numunenin beş mikrolitresini kolona enjekte edin. Ve karbon-12 aniline etiketli örnek için z iyon yoğunlukları üzerinde uygun m elde. Sonra, aynı örnekten beş mikrolitre tekrar enjekte edin.
Ve karbon-13 aniline etiketli standartları için z iyon yoğunlukları üzerinde m elde. Bu protokolde, E.coli tabanlı hücre içermeyen protein sentezinde yeşil floresan proteini ifade eden metabolitler ölçüldü. Merkezi karbon ve enerji metabolizmasında yer alan 40 metabolit iç standartlar kullanılarak tespit edildi ve ölçüldü.
Anilin ile etiketlenmemiş metabolitlerin beşi için standart bir eğri de geliştirilmiştir. Bu yollarda yer alan çeşitli metabolitler fosforilasyonlu şekerler, fosfo-karboksilik asitler, karboksilik asitler, nükleotidler ve ko-faktörler sınıfıydı. Buna ek olarak, yöntem tek bir LC-MS çalışmasında glukoz-altı fosfat ve fruktoz-altı fosfat gibi yapısal izomer çiftlerinin ayrılmasını sağladı.
En önemli adım de-proteinleşmiş örnek anin ile etiketleme olduğunu. Aniline çözüm ayrılır yana, iyi güvenlik uygulamaları korurken, hızlı ve etkili bir şekilde çalışmak önemlidir. Bu yöntem 40 metabolitin nicelliği ile hücresiz metabolizmayı karakterize etmeye yardımcı olur.
Ama, ek bileşikler hücre içermeyen karışımı bulunmaktadır, bu sayısal olabilir amino asitler gibi. Bu hücresiz metabolizma içine daha kapsamlı bir görünüm sağlanmasında yardımcı olacaktır. Bu yöntem, hücresiz sistemlerin daha iyi enerji verimliliği ve karbon verimi için potansiyel olarak yararlanılabilen karmaşık metabolizmalara sahip olduğunu ortaya koymuştur.
Protokol, bileşiklerin anilin ile etiketleetiketlep EDC'nin katalizör olarak kullanılmasına dayanır. Her iki reaktif tehlikelidir ve dikkatli kullanılmalıdır.
