La synthèse des protéines sans cellules est une technologie émergente dans les systèmes et la biologie synthétique pour la production in vitro de protéines. Les systèmes de synthèse des protéines sans cellules n’ont pas de paroi cellulaire, nous avons donc un accès direct aux métabolites. Dans ce protocole, nous quantifions les mesures absolues de 40 métabolites impliqués dans le métabolisme central du carbone et de l’énergie, ce qui nous permet de caractériser le métabolisme sans cellules.
Le protocole repose sur la métastasation des composés avec de l’aniline, ce qui permet une meilleure séparation et une résolution de spectrométrie de masse plus élevée. En outre, nous utilisons des normes internes avec une aniline isotopique que nous étiqueterons, pour la quantification absolue des métabolites. Les métabolites marqués coelute, qui élimine les effets de la suppression du fer.
Permettant la quantification précise des composés. En travaillant dans une hotte, combiner 550 microlitres de l’aniline, avec 337,5 microlitres d’eau de qualité LC-MS. Et 112,5 microlitres de 12 acides chlorhydriques molaires dans un tube de centrifugeuse.
Vortex bien, et stocker la solution aniline six molaire à pH 4,5 et quatre degrés Celsius. Pour préparer une solution d’aniline de carbone-13 de six molaires, au pH 4.5, combinez 250 milligrammes d’aniline de carbone-13 avec 132 microlitres d’eau, et 44 microlitres de 12 acides chlorhydriques molaires. Vortex bien, et stocker à quatre degrés Celsius.
Pour préparer une solution EDC de 200 milligrammes par millilitre, dissoudre deux milligrammes d’EDC en 10 microlitres d’eau pour chaque échantillon à ce qu’il soit étiqueté. Et vortex bien. Pour préparer des échantillons, étanchez et précipitez les protéines dans une réaction de synthèse de protéine sans cellules, en ajoutant un volume égal d’éthanol glacé à 100 % à la réaction de synthèse sans cellules.
Centrifugez l’échantillon à 12 000 fois g, pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Transférer le supernatant de l’échantillon dans un nouveau tube de centrifugeuse. Pour étiqueter l’échantillon avec la solution d’aniline de carbone-12, transférez six microlitres de l’échantillon dans un nouveau tube de centrifugeuse, et apportez le volume à 50 microlitres avec de l’eau.
Ajouter 5 microlitres de 200 milligrammes par millilitre de solution EDC, bien mélanger la solution aniline carbone-12 et transférer 5 microlitres dans le tube. Vortex la réaction avec des secousses douces pendant deux heures à température ambiante. Après deux heures, retirez les tubes du shaker et transférez-les dans une hotte fumigène.
Ajouter 1,5 microlitres de triéthylamine à chaque réaction pour arrêter la réaction d’étiquetage de l’aniline et stabiliser les composés. Centrifugeuse à 13 500 g pendant trois minutes. Et sauver le surnatant.
Pour étiqueter les normes internes avec la solution aniline carbon-13, diluer la solution de stock interne à 80 micromolaires avec un volume final de 50 microlitres. Ajoutez cinq microlitres de la solution EDC de 200 milligrammes par millilitre et cinq microlitres de la solution aniline de carbone-13 bien mélangée. Vortex la réaction avec des secousses douces pendant deux heures à température ambiante.
Après deux heures, retirer les tubes du shaker et ajouter 1,5 microlitres de triethylamine à la réaction dans une hotte fumigène. Centrifugeuse à 13, 500 fois g pendant trois minutes et sauver le surnatant. Pour deviner la norme interne marquée, et l’échantillon marqué, mélangez 25 microlitres de chacun dans un flacon d’autosampler.
Et analyser par la procédure LC-MS. Ensuite, pour créer une courbe standard pour les métabolites non étiquetés, d’abord, diluer la solution de stock de métabolites non marqués à différentes concentrations, avec un volume de 50 microlitres. Ajoutez cinq microlitres de la solution EDC de 200 milligrammes par millilitre et cinq microlitres de solution aniline carbone-12 à chaque concentration.
Vortex la réaction avec des secousses douces pendant deux heures à température ambiante. Et procéder au traitement à la triethylamine. Et centrifugalisation avant d’analyser par le LC-MS comme précédemment.
Après avoir para para parasé para paramètre LC-MS, selon les instructions du fabricant, injecter cinq microlitres de l’échantillon dans la colonne. Et acquérir les intensités appropriées m sur z ion pour l’échantillon marqué de carbone-12 aniline. Ensuite, injectez à nouveau cinq microlitres d’un même échantillon.
Et acquérir les intensités m over z ion pour les normes étiquetées carbone-13 aniline. Dans ce protocole, les métabolites exprimant la protéine fluorescente verte dans une synthèse de protéine cellule-libre à base d’E.coli ont été quantifiés. 40 métabolites impliqués dans le métabolisme central du carbone et de l’énergie, ont été détectés et quantifiés à l’aide de normes internes.
Alors qu’une courbe standard pour cinq des métabolites qui n’ont pas été marqués avec de l’aniline a également été développée. Les divers métabolites impliqués dans ces voies étaient une classe de sucres phosphorylatés, d’acides phospho-carboxyliques, d’acides carboxyliques, de nucléotides et de co-facteurs. En outre, la méthode a permis la séparation des paires structurales d’isomer, telles que le phosphate de glucose-six, et le phosphate de fructose-six dans une seule course de LC-MS.
L’étape la plus importante consiste à étiqueter l’échantillon démétéiné d’aniline. Comme la solution aniline se sépare, il est important de travailler rapidement et efficacement, tout en maintenant de bonnes pratiques de sécurité. Cette méthode aide à caractériser le métabolisme sans cellules avec la quantification de 40 métabolites.
Mais, composés supplémentaires sont dans le mélange sans cellules, tels que les acides aminés qui peuvent être quantifiés. Cela aiderait à fournir un regard plus complet sur le métabolisme sans cellules. Cette méthode a révélé que les systèmes sans cellules ont des métabolismes complexes, fonctionnant toujours qui peuvent être potentiellement exploités pour une meilleure efficacité énergétique et le rendement en carbone.
Le protocole repose sur l’étiquetage des composés avec de l’aniline avec l’utilisation d’EDC comme catalyseur. Ces deux reagents sont dangereux et doivent être utilisés avec prudence.
