Die zellfreie Proteinsynthese ist eine neue Technologie in Systemen und synthetischer Biologie für die In-vitro-Produktion von Proteinen. Zellfreie Proteinsynthesesysteme haben keine Zellwand, so dass wir direkten Zugang zu Metaboliten haben. In diesem Protokoll quantifizieren wir die absoluten Messungen von 40 Metaboliten, die am zentralen Kohlenstoff- und Energiestoffwechsel beteiligt sind, was es uns ermöglicht, den zellfreien Stoffwechsel zu charakterisieren.
Das Protokoll beruht auf der Metastasierung der Verbindungen mit Aniline, was eine bessere Trennung und eine höhere Massenspektrometrieauflösung ermöglicht. Darüber hinaus verwenden wir interne Standards mit einem Isotop, das wir aniline kennzeichnen, für die absolute Quantifizierung der Metaboliten. Die markierten Metaboliten coelute, die die Auswirkungen der Eisenunterdrückung eliminiert.
Ermöglicht die genaue Quantifizierung der Verbindungen. In einer Haube arbeiten, kombinieren 550 Mikroliter der Aniline, mit 337,5 Mikroliter LC-MS-Grade Wasser. Und 112,5 Mikroliter 12 Molsalzsäure in einem Zentrifugenrohr.
Vortex gut, und speichern Sie die sechs Mol aniline Lösung bei pH 4,5 und vier Grad Celsius. Zur Herstellung einer sechs mollaren Carbon-13-Aniinlösung bei pH 4,5 werden 250 Milligramm Kohlenstoff-13-Aniin mit 132 Mikroliter Wasser und 44 Mikroliter 12 Molsalzsäure kombiniert. Vortex gut, und lagern bei vier Grad Celsius.
Um 200 Milligramm pro Milliliter EDC-Lösung vorzubereiten, lösen Sie zwei Milligramm EDC in 10 Mikroliter Wasser für jede Probe, die getaggt werden soll. Und Wirbel gut. Um Proben zuzubereiten, löschen und fällen Sie die Proteine in einer zellfreien Proteinsynthesereaktion, indem Sie der zellfreien Synthesereaktion ein gleiches Volumen eiskaltes 100%Ethanol hinzufügen.
Zentrifugieren Sie die Probe bei 12 000 mal g, für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie den Überstand der Probe in ein neues Zentrifugenrohr. Um die Probe mit Carbon-12-Anilinelösung zu kennzeichnen, übertragen Sie sechs Mikroliter der Probe in ein neues Zentrifugenrohr und bringen Sie das Volumen mit Wasser auf 50 Mikroliter.
Fügen Sie 5 Mikroliter von 200 Milligramm pro Milliliter EDC-Lösung hinzu, mischen Sie die Carbon-12-Aniinlösung gut und übertragen Sie 5 Mikroliter in die Röhre. Wirbeln Sie die Reaktion mit sanftem Schütteln für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Nach zwei Stunden die Rohre vom Shaker entfernen und in eine Dunstabzugshaube geben.
Fügen Sie 1,5 Mikroliter Triethylamin zu jeder Reaktion hinzu, um die Aniline-Tagging-Reaktion zu stoppen und die Verbindungen zu stabilisieren. Zentrifuge bei 13, 500 mal g für drei Minuten. Und den Überstand retten.
Um die internen Standards mit Carbon-13-Aniline-Lösung zu kennzeichnen, verdünnen Sie die interne Lagerlösung auf 80 Mikromolar mit einem Endvolumen von 50 Mikrolitern. Fügen Sie fünf Mikroliter der 200 Milligramm pro Milliliter EDC-Lösung und fünf Mikroliter der gut gemischten Carbon-13-Aniinlösung hinzu. Wirbeln Sie die Reaktion mit sanftem Schütteln für zwei Stunden bei Raumtemperatur.
Nach zwei Stunden, entfernen Sie die Rohre aus dem Shaker, und fügen Sie 1,5 Mikroliter Triethylamin zur Reaktion in einer Rauchhaube. Zentrifuge bei 13, 500 mal g für drei Minuten und den Überstand speichern. Um den getaggten internen Standard und die getaggte Probe zu göttlich zu machen, mischen Sie jeweils 25 Mikroliter in einer Autosampler-Durchstechflasche.
Und analysieren Sie nach dem LC-MS-Verfahren. Um dann eine Standardkurve für nicht getaggte Metaboliten zu erstellen, verdünnen Sie zunächst die Stammlösung von nicht markierten Metaboliten auf verschiedene Konzentrationen mit einem Volumen von 50 Mikrolitern. Fügen Sie fünf Mikroliter der 200 Milligramm pro Milliliter EDC-Lösung und fünf Mikroliter Kohlenstoff-12-Aniinlösung zu jeder Konzentration hinzu.
Wirbeln Sie die Reaktion mit sanftem Schütteln für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Und fahren Sie mit der Triethylamin-Behandlung fort. Und Zentrifugalisierung vor der Analyse durch die LC-MS wie bisher.
Nach der Initialisierung von LC-MS, gemäß den Anweisungen des Herstellers, injizieren Sie fünf Mikroliter der Probe in die Säule. Und erwerben Sie die entsprechenden m über z Ionenintensitäten für die Carbon-12-Aniin-getaggte Probe. Dann injizieren Sie fünf Mikroliter der gleichen Probe erneut.
Und erwerben Sie die m over z Ionenintensitäten für die Carbon-13 Aniline-markierten Standards. In diesem Protokoll wurden Metaboliten, die grünes fluoreszierendes Protein in einer E.coli-basierten zellfreien Proteinsynthese exdrücken, quantifiziert. 40 Metaboliten, die am zentralen Kohlenstoff- und Energiestoffwechsel beteiligt waren, wurden anhand interner Standards nachgewiesen und quantifiziert.
Während eine Standardkurve für fünf der Metaboliten, die nicht mit Aniline markiert wurden, ebenfalls entwickelt wurde. Die verschiedenen Metaboliten, die an diesen Bahnen beteiligt waren, waren eine Klasse von phosphorylierten Zuckern, Phospho-Carbonsäuren, Carbonsäuren, Nukleotiden und Co-Faktoren. Darüber hinaus ermöglichte das Verfahren die Trennung von strukturellen Isomerpaaren wie Glucose-Sechsphosphat und Fructose-sechs Phosphat in einem einzigen LC-MS-Lauf.
Der wichtigste Schritt ist die Kennzeichnung der entproteinisierten Probe mit Aniline. Da sich die aniline Lösung trennt, ist es wichtig, schnell und effektiv zu arbeiten und dabei gute Sicherheitspraktiken beizubehalten. Diese Methode hilft, den zellfreien Stoffwechsel mit der Quantifizierung von 40 Metaboliten zu charakterisieren.
Aber, zusätzliche Verbindungen sind in der zellfreien Mischung, wie Aminosäuren, die quantifiziert werden können. Dies würde helfen, einen umfassenderen Blick in den zellfreien Stoffwechsel zu bieten. Diese Methode zeigte, dass zellfreie Systeme komplexe Stoffwechselhaben haben, die immer noch in Betrieb sind und potenziell für eine bessere Energieeffizienz und Kohlenstoffausbeute genutzt werden können.
Das Protokoll beruht auf der Kennzeichnung der Verbindungen mit Aniin mit der Verwendung von EDC als Katalysator. Beide Reagenzien sind gefährlich und sollten mit Vorsicht angewendet werden.
