La sintesi proteica senza cellule è una tecnologia emergente nei sistemi e nella biologia sintetica per la produzione in vitro di proteine. I sistemi di sintesi proteica senza cellule non hanno pareti cellulari, quindi abbiamo accesso diretto ai metaboliti. In questo protocollo, quantifichiamo le misurazioni assolute di 40 metaboliti coinvolti nel metabolismo centrale del carbonio e dell'energia, che ci consente di caratterizzare il metabolismo privo di cellule.
Il protocollo si basa sulla metastasi dei composti con anilina, che consente una migliore separazione e una maggiore risoluzione della spettrometria di massa. Inoltre, utilizziamo standard interni con un isotopico etilichettiamo l'anilina, per la quantificazione assoluta dei metaboliti. I metaboliti taggati coelute, che elimina gli effetti della soppressione del ferro.
Consentendo l'accurata quantificazione dei composti. Lavorando in una cappa, unire 550 microlitri dell'anilina, con 337,5 microlitri di acqua di grado LC-MS. E 112,5 microlitri di 12 acido cloridrico molare in un tubo di centrifuga.
Vortice bene, e conservare la soluzione di anilina molare a pH 4.5 e quattro gradi Celsius. Per preparare una soluzione di anilina a sei molari carbonio-13, a pH 4,5, combinare 250 milligrammi di anilina carbonio-13 con 132 microlitri di acqua e 44 microlitri di 12 acido cloridrico molare. Vortice bene, e memorizzare a quattro gradi Celsius.
Per preparare soluzione EDC da 200 milligrammi per millilitro, sciogliere due milligrammi di EDC in 10 microlitri d'acqua per ogni campione da etichettare. E vortice bene. Per preparare campioni, dissetare e precipitare le proteine in una reazione di sintesi proteica priva di cellule, aggiungendo un volume uguale di etanolo ghiacciato al 100% alla reazione di sintesi priva di cellule.
Centrifugare il campione a 12.000 volte g, per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il supernatante del campione in un nuovo tubo di centrifuga. Per etichettare il campione con una soluzione di anilina al carbonio-12, trasferire sei microlitri del campione in un nuovo tubo di centrifuga e portare il volume a 50 microlitri con acqua.
Aggiungere 5 microlitri da 200 milligrammi per millilitro soluzione EDC, mescolare bene la soluzione di anilina carbonio-12 e trasferire 5 microlitri nel tubo. Vortice la reazione con agitazione delicata per due ore a temperatura ambiente. Dopo due ore, rimuovere i tubi dallo shaker e trasferirli in una cappa aspirante.
Aggiungere 1,5 microlitri di trietilammina ad ogni reazione per arrestare la reazione di tagging dell'anilina e stabilizzare i composti. Centrifuga a 13.500 volte g per tre minuti. E salva il supernatante.
Per etichettare gli standard interni con soluzione di anilina carbon-13, diluire la soluzione di stock interno a 80 micromolari con un volume finale di 50 microlitri. Aggiungere cinque microlitri della soluzione EDC da 200 milligrammi per millilitro e cinque microlitri della soluzione di anilina carbon-13 ben miscelata. Vortice la reazione con agitazione delicata per due ore a temperatura ambiente.
Dopo due ore, rimuovere i tubi dallo shaker e aggiungere 1,5 microlitri di trietilammina alla reazione in una cappa aspirante. Centrifuga a 13.500 volte g per tre minuti e salva il supernatante. Per intuire lo standard interno taggato e il campione taggato, mescolare 25 microlitri di ciascuno in una fiala autocampionatore.
E analizzare con la procedura LC-MS. Quindi, per creare una curva standard per i metaboliti non registrati, in primo luogo, diluire la soluzione stock di metaboliti non registrati a diverse concentrazioni, con volume di 50 microlitri. Aggiungere cinque microlitri della soluzione EDC da 200 milligrammi per millilitro e cinque microlitri di soluzione di anilina carbonio-12 ad ogni concentrazione.
Vortice la reazione con agitazione delicata per due ore a temperatura ambiente. E procedere con il trattamento con trietilammina. E centrifugazione prima di analizzare da parte dell'LC-MS come in precedenza.
Dopo aver inizializzato LC-MS, secondo le istruzioni del produttore, iniettare cinque microlitri del campione nella colonna. E acquisire le intensità di ioni m su z appropriate per il campione etichettato di anilina carbonio-12. Quindi, iniettare di nuovo cinque microlitri dello stesso campione.
E acquisire le intensità ionici m over z per gli standard etichettati carbonio-13 anilina. In questo protocollo sono stati quantificati metaboliti che esprimono proteine fluorescenti verdi in una sintesi proteica priva di cellule a base di E.coli. 40 metaboliti coinvolti nel metabolismo centrale del carbonio e dell'energia sono stati individuati e quantificati secondo norme interne.
Mentre è stata sviluppata anche una curva standard per cinque dei metaboliti che non sono stati taggati con anilina. I diversi metaboliti coinvolti in queste vie erano una classe di zuccheri fosforilati, acidi fosfo-carbossilici, acidi carbossilici, nucleotidi e co-fattori. Inoltre, il metodo ha permesso la separazione di coppie di isomero strutturali, come il glucosio-sei fosfato e il fruttosio-sei fosfato in una singola corsa LC-MS.
Il passo più importante è etichettare il campione de-proteinizzato con anilina. Poiché la soluzione anilina si separa, è importante lavorare in modo rapido ed efficace, mantenendo al contempo buone pratiche di sicurezza. Questo metodo aiuta a caratterizzare il metabolismo senza cellule con la quantificazione di 40 metaboliti.
Ma, altri composti sono nella miscela priva di cellule, come gli amminoacidi che possono essere quantificati. Ciò aiuterebbe a fornire uno sguardo più completo sul metabolismo privo di cellule. Questo metodo ha rivelato che i sistemi senza cellule hanno metabolismi complessi, ancora in funzione che possono essere potenzialmente sfruttati per una migliore efficienza energetica e una resa di carbonio.
Il protocollo si basa sull'etichettatura dei composti con anilina con l'uso di EDC come catalizzatore. Entrambi questi reagenti sono pericolosi e devono essere utilizzati con cautela.
