Bu çalışma İsrail Ticaret ve Çalışma Bakanlığı'nın KAMIN programı ve Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, ABD tarafından finanse edilmiştir.

Bu protokolde hayvanların kullanımı Ulusal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
NOT: Kalsiyum karbonatlı mercan iskeletleri, aragonitin kristal formunda kullanılmalıdır. Nöral kültürler için şimdiye kadar test edilen mercan türleri Porites Lutea, Stylophora Pistillata ve Trachyphyllia Geoffroyi'dir. İskeletler tamamen veya öğütülmüş olarak satın alınabilir.
1. Mercan iskelet parçalarının temizlenmesi
DİKKAT: Aşağıdaki adımlar oda sıcaklığında kimyasal bir davlumbazda gerçekleştirilmelidir, çünkü aşağıda açıklanan çözeltiler tehlikelidir ve yanıklara ve tahrişlere neden olabilir.
<ol><li>Mercan iskeletini kırmak ve 0,5-2 cm'lik parçalara bölmek için bir çekiç kullanın. Organik ve organik olmayan kalıntıları çözmek için, mercan iskelet parçalarını 10 dakika boyunca% 10 sodyum hipoklorit çözeltisine batırın, ardından bir kez çift damıtılmış su (DDW) ile yıkayın.</li>
	<li>Kalan organik kalıntıları gidermek için, parçaları 5 dakika boyunca 1M NaOH çözeltisine batırın, ardından DDW ile bir kez yıkayın. Parçaları 10 dakika boyunca% 30H2O2 çözeltisine batırarak organik birikintilerin uzaklaştırılmasına devam edin, ardından parçaları DDW ile 3x yıkayın.</li>
	<li>Mümkün olduğunca fazla DDW'yi çıkarın ve mercan parçalarını davlumbazda kurumaya bırakın (1-8 saat).</li>
</ol>2. Cam kapakların temizlenmesi
<ol><li>Cam kapakları 100 mm'lik bir cam Petri kabına aktarın. 15 dakika boyunca 10 mL% 95 etanol ekleyin.</li>
	<li>Etanol çıkarın ve DDW 3x ile yıkayın, her yıkama arasında 10 dakika bekleyin. Çanağı, DDW buharlaşana kadar 80 ° C önceden ısıtılmış bir ısıtma plakasına yerleştirin. Birbirlerine yapışmalarını önlemek için kururken plaka içindeki kapakları birkaç kez hafifçe karıştırın.</li>
	<li>Kapak fişlerini otoklavlayın.</li>
</ol>3. Mercan iskelet tanelerinin hazırlanması
<ol><li>Mercan iskelet parçalarını bir harç ve havan (manuel taşlama) kullanarak tamamen parçalanana kadar öğütün. Sonuç, 20 μm-200 μm arasında değişen boyutlara sahip tanelerin bir karışımıdır.</li>
	<li>Alternatif olarak, mercan iskelet parçalarını elektrikli bir taşlama makinesi kullanarak 30 s boyunca 1.000 rpm hızında öğütün (bıçak uzunluğu = 6 cm; genişlik = 0,5 cm-1,0 cm). Elde edilen tane boyutu, manuel taşlama ile üretilen boyut aralığına benzer.</li>
</ol>4. Belirli bir boyut aralığındaki tanelerin saflaştırılması
NOT: Bir matristeki taneciklerin boyutu üzerinde kontrol isteniyorsa, aşağıdaki filtreleme tabanlı tane saflaştırma prosedürünü kullanın.
<ol><li>Taneleri manuel veya elektrikli 40 μm filtre örgü süzgecine aktarın.</li>
	<li>Taneleri süzgeçten geçirerek taneleri iki spesifik aralığa bölün (elektrikli süzgeç kullanılıyorsa, aşağıdaki koşullar önerilir: sallama = 600 genlik / dak, sıçrama = 6 / s). Bu prosedür, biri <40 μm ve ikincisi >40 μm olmak üzere iki grup tane boyutu üretir. NOT: İki boyut, farklı kafeslere sahip süzgeçler kullanılarak belirlenebilir. Daha kısıtlı bir aralık isteniyorsa, adım 4.2'den itibaren her grubu farklı kafeslere sahip süzgeçler aracılığıyla yeniden eleyin.</li>
	<li>Taneleri otoklavlayın.</li>
</ol>5. Mercan tanesi kaplı tabakların veya örtülerin hazırlanması
<ol><li>Şişeleri, tabakları veya Petri tabaklarını kaplamak için NOT: Aşağıdaki adımlar steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir.<ol><li>Mercan iskelet tanelerini, Hanks çözeltisinde çözünmüş 20 μg / mL poli-D-lizin (PDL) çözeltisine ekleyin. Önerilen konsantrasyon, 1 mL PDL çözeltisi başına 5 mg / 10 mg tahıldır.</li>
		<li>Çözeltiyi şişelere ve tabaklara (yaklaşık 2 mL / 25cm2) dökün ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Taneler batar ve dibe yapışır.</li>
		<li>Ertesi gün, şişeleri ve bulaşıkları steril DDW ile bir kez yıkayın. Şişelerin ve bulaşıkların davlumbazda kurumasını bekleyin. NOT: Taze kaplanmış şişe ve tabakların kullanılması tercih edilir. Kaplanan şişeler ve tabaklar, 4 °C'de muhafaza edilirse kaplamadan sonra bir haftaya kadar kullanılabilir. Bununla birlikte, matrisin etkinliği tehlikeye girebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Kaplama cam kapakları (12 mm çap, 0,17 mm kalınlık)<ol><li>İstenilen herhangi bir konsantrasyonda DDW'ye mercan iskelet taneleri ekleyin. Nöral hücreler için kullanılan yaygın yoğunluklar 5 mg / mL ve 10 mg / mL'dir. Tane çözeltisinin 40 μL'sini kapak kaymasının ortasına dökün (Şekil 4).</li>
		<li>Kapak fişlerini 80 ° C'ye önceden ısıtılmış bir ısıtma plakasına yerleştirin ve tam buharlaşmayı bekleyin (genellikle 15 dakika). Bu koşullar altında, taneler kapak kaymasına yapışır. Kaplanmış kapak fişlerini otoklavlayın. Steril koşullarda saklayın.</li>
		<li>Kültürden bir gün önce, kapakları steril bir 24 kuyucuk plakasının kapağına yerleştirin. Her bir kapak fişine 100 μL 20 μg/mL PDL çözeltisi ekleyin. Sıvının tüm tane bölgesini ve kapak kayma yüzeyinin geri kalanını kapladığından emin olmak için ucu kullanın.</li>
		<li>Kapağı plakanın alt kısmıyla örtün. Plakaların kenarlarını parafin film ile sarın. Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.</li>
		<li>Ertesi gün, DDW ile bir kez yıkayın ve davlumbazda kurutun. NOT: Taze kaplamalı kapakların kullanılması tercih edilir.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Mercan iskeleti tahıl kaplı cam örtüler üzerinde hipokampal ayrışmış hücrelerin yetiştirilmesi
NOT: Hipokampal ayrışmış hücre kültürü için yöntem daha önce yayınlanmış prosedürlerden24,27 olarak değiştirilmiştir. Kültürün hazırlanması dört sıçan yavrusu için tarif edilmiştir. Her hipokampustan beklenen verim 1–1.5 x 106 hücredir.
<ol><li>Kurulum<ol><li>Boş bir 60 mm Petri kabı hazırlayın. 60 mm'lik bir Petri kabına 2 mL minimal esansiyel ortam (MEM) dökün ve buz üzerine koyun.</li>
		<li>35 mm'lik bir kaba 2 mL MEM dökün ve 37 ° C'de,% 5-10 CO2'de bir inkübatöre koyun. 15 mL'lik bir tüpe 2 mL MEM dökün ve 4 ° C'de tutun.</li>
		<li>15 mL'lik bir tüpe 1 mL İlk Gün Ortamı dökün ve 37 ° C'de,% 5-10 CO2'de bir inkübatöre koyun. NOT: İlk Gün Ortamının bileşimi Malzemeler Tablosunda açıklanmıştır.</li>
		<li>200 μL'lik %2.5'lik tripsin çözeltisini çözün ve 37 °C'de inkübe edin.</li>
		<li>Alev kullanarak 0,5 mm, 0,75 mm ve 1,0 mm çapında kafalara sahip üç cam Pasteur pipet hazırlayın.</li>
		<li>Yeterli cerrahi aletler hazırlayın: bir büyük makas, iki küçük makas, bir büyük cımbız, dört küçük cımbız ve bir neşter.</li>
		<li>Kaputta bir stereomikroskop hazırlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Büyük bir makas kullanarak, 0-3 günlük Sprague Dawley sıçan yavrularını kafalarını vücutlarından ayırarak boş bir 60 mm Petri kabına kurban edin (adım 6.1.1). Cesetleri atın.</li>
	<li>Kafayı büyük bir cımbızla ağızdan tutarak alın. Kafatasını kaplayan cildi küçük bir makasla kesin.</li>
	<li>Temiz bir makasla kafatasının altına (beyincik tarafında) girin ve çıkarılmasını sağlamak için kafatasını sağa ve sola kesin. Küçük bir cımbız kullanarak, kafatasını beyinden çıkarın.</li>
	<li>Temiz bir cımbız ile, beyni kafadan ayırın ve 2 mL soğuk MEM içeren 60 mm'lik bir Petri kabına koyun (bkz. adım 6.1.2).</li>
	<li>İki küçük cımbız kullanarak, hipokampiyi stereomikroskop altında parçalayın. Hipokampi, MEM içeren hazırlanmış 35 mm'lik kaba (adım 6.1.2'den itibaren) aktarın. NOT: Her yavru için 6.3-6.6 arası adımlar tekrarlanmalıdır.</li>
	<li>Neşteri kullanarak hipokampiyi yaklaşık 1 mm'lik dilimlere kesin. 200 μL tripsin çözeltisi ekleyin (% 0.25'lik bir nihai konsantrasyona seyreltilir). Yavaşça karıştırın ve 37 ° C'de,% 5-10 CO2'de 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Kuluçkadan sonra, tripsini devre dışı bırakmak için yemeğe 2 mL soğuk MEM (adım 6.1.2) ekleyin. Tripsinize edilmiş dokuyu, en büyük çapa sahip cam Pasteur pipeti (adım 6.1.5) kullanarak 37 °C'ye (adım 6.1.3) önceden ısıtılmış 1 mL İlk Gün Ortamı içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın. NOT: Dokunun daha fazla işlenmesi için en iyi orta-doku (v:v) oranı 1 mL/8 hipokampidir. Ortamı mümkün olduğunca doku ile transfer etmekten kaçının.</li>
	<li>Dokuyu en büyük çaplı cam pipetten 10-15 kez geçirerek tritüre edin. Ardından, orta çaplı cam pipeti kullanarak bu işlemi tekrarlayın. En küçük çaplı pipetle tritürasyona devam edin. Hücre ölümünü azaltmak için köpürmekten kaçının.</li>
	<li>Kalan doku parçalarının 2-5 dakika batmasına izin verin, ardından süpernatantı başka bir 15 mL tüpe aktarın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. NOT: Tercih edilen hücre yoğunluğu 200.000-400.000 hücre/mL'dir. Hücreleri konsantre etmek için 470 x g'de seyreltmek veya santrifüjlemek için İlk Gün Ortamını kullanın.</li>
	<li>Her cam kapak üzerine 100 μL hücre tohumlayın. Tohumlama sırasında, tüm kapak kaymasını hücrelerle kapladığınızdan emin olun. 37 ° C'de,% 5-10 CO2'de inkübe edin.</li>
	<li>Ertesi gün, kuyucuklara 500 μL Nöronal Büyüme Ortamı ekleyin. NOT: Nöronal Büyüme Ortamının bileşimi Malzeme Tablosunda açıklanmıştır.</li>
	<li>Her bir kapak fişini cımbız kullanarak nazikçe uygun kuyucuğuna aktarın ve kapak kapağını eğerek İlk Gün Ortamını çıkarın. Kalan ortamı kapaktan emin.</li>
	<li>37 ° C'de,% 5-10 CO2'de inkübe edin. Kuluçka boyunca ortamı değiştirmekten kaçının. Kültürler bu koşullar altında 1 aya kadar muhafaza edilebilir. En büyük endişe nemdir. Bu nedenle, inkübatörün maksimum nemli tutulduğundan emin olun.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+method+to+manipulate+the+direction+and+functional+strength+between+neural+populations.">An in vitro method to manipulate the direction and functional strength between neural populations.</a> Frontiers in Neural Circuits. 9, 32 (2015).</li><li>Wellbourne-Wood, J., Chatton, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Cultured+Rodent+Neurons+to+Human+Brain+Tissue:+Model+Systems+for+Pharmacological+and+Translational+Neuroscience.">From Cultured Rodent Neurons to Human Brain Tissue: Model Systems for Pharmacological and Translational Neuroscience.</a> ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 1975-1985 (2018).</li><li>Moln&#225;r, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+potentiation+in+cultured+hippocampal+neurons.">Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).</li><li>Silva, R. F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociated+primary+nerve+cell+cultures+as+models+for+assessment+of+neurotoxicity.">Dissociated primary nerve cell cultures as models for assessment of neurotoxicity.</a> Toxicology Letters. 163 (1), 1-9 (2006).</li><li>Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Overview+of+in+vitro+Methods+to+Study+Microglia.">An Overview of in vitro Methods to Study Microglia.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, (2018).</li><li>Ogata, N., Tatebayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+mammalian+brain+neurons+and+its+application+to+patch-clamp+recording.">Primary culture of mammalian brain neurons and its application to patch-clamp recording.</a> Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 98 (4), 245-250 (1991).</li><li>Lonchamp, E., Dupont, J. L., Beekenkamp, H., Poulain, B., Bossu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+cerebellar+cortex+in+organotypic+slice+cultures:+an+in+vitro+model+to+analyze+the+consequences+of+mutations+and+pathologies+on+neuronal+survival,+development,+and+function.">The mouse cerebellar cortex in organotypic slice cultures: an in vitro model to analyze the consequences of mutations and pathologies on neuronal survival, development, and function.</a> Critical Reviews in Neurobiology. 18 (1-2), 179-186 (2006).</li><li>Weiss, O. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+scar+tissue+formation+in+injured+nervous+tissue+cultivated+on+surface-engineered+coralline+scaffolds.">Modulation of scar tissue formation in injured nervous tissue cultivated on surface-engineered coralline scaffolds.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. , (2017).</li><li>Chen, J., Herrup, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+neurons+in+primary+cultures+and+in+neurodegenerative+diseases.">Selective vulnerability of neurons in primary cultures and in neurodegenerative diseases.</a> Reviews in the Neurosciences. 19 (4-5), 317-326 (2008).</li><li>Potter, S. M., DeMarse, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+neural+cell+culture+for+long-term+studies.">A new approach to neural cell culture for long-term studies.</a> Journal of Neuroscience Methods. 110 (1-2), 17-24 (2001).</li><li>Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+considerations+for+live+imaging+of+developing+hippocampal+neurons+in+culture.">General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), 312-318 (2012).</li><li>Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+3D+Glial+Cell+Culture+Systems+and+Applications+for+Neurodegeneration+and+Neuroinflammation.">Bioengineered 3D Glial Cell Culture Systems and Applications for Neurodegeneration and Neuroinflammation.</a> SLAS discovery: Advancing Life Sciences R &amp; D. 22 (5), 583-601 (2017).</li><li>Karimi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+systems+for+stem+cell-based+neural+tissue+engineering.">Microfluidic systems for stem cell-based neural tissue engineering.</a> Lab on a Chip. 16 (14), 2551-2571 (2016).</li><li>Murphy, A. R., Laslett, A., O'Brien, C. M., Cameron, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffolds+for+3D+in+vitro+culture+of+neural+lineage+cells.">Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells.</a> Acta Biomaterialia. 54, 1-20 (2017).</li><li>Walker, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Progenitor+Cell+Therapy+Using+Scaffolding+Constructs+for+Central+Nervous+System+Injury.">Advances in Progenitor Cell Therapy Using Scaffolding Constructs for Central Nervous System Injury.</a> Stem Cell Reviews. 5 (3), 283-300 (2009).</li><li>Pettikiriarachchi, J. T. S., Parish, C. L., Shoichet, M. S., Forsythe, J. S., Nisbet, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+for+Brain+Tissue+Engineering.">Biomaterials for Brain Tissue Engineering.</a> Australian Journal of Chemistry. 63 (8), 1143-1154 (2010).</li><li>Lu, T., Li, Y., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+fabrication+and+construction+of+three-dimensional+scaffolds+for+tissue+engineering.">Techniques for fabrication and construction of three-dimensional scaffolds for tissue engineering.</a> International Journal of Nanomedicine. 8, 337-350 (2013).</li><li>Maclean, F. L., Rodriguez, A. L., Parish, C. L., Williams, R. J., Nisbet, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+Biomaterials+and+Stem+Cells+for+Neural+Regeneration.">Integrating Biomaterials and Stem Cells for Neural Regeneration.</a> Stem Cells and Development. 25 (3), 214-226 (2016).</li><li>Drury, J. L., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+tissue+engineering:+scaffold+design+variables+and+applications.">Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications.</a> Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).</li><li>Woerly, S., Marchand, R., Lavall&#233;e, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebral+implantation+of+synthetic+polymer/biopolymer+matrix:+a+new+perspective+for+brain+repair.">Intracerebral implantation of synthetic polymer/biopolymer matrix: a new perspective for brain repair.</a> Biomaterials. 11 (2), 97-107 (1990).</li><li>Dillon, G. P., Yu, X., Sridharan, A., Ranieri, J. P., Bellamkonda, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+physical+structure+and+charge+on+neurite+extension+in+a+3D+hydrogel+scaffold.">The influence of physical structure and charge on neurite extension in a 3D hydrogel scaffold.</a> Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 9 (10), 1049-1069 (1998).</li><li>Carballo-Molina, O. A., Velasco, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+scaffolds+and+delivery+systems+to+enhance+axonal+regeneration+after+injuries.">Hydrogels as scaffolds and delivery systems to enhance axonal regeneration after injuries.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).</li><li>George, J., Hsu, C. C., Nguyen, L. T. B., Ye, H., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+tissue+engineering+with+structured+hydrogels+in+CNS+models+and+therapies.">Neural tissue engineering with structured hydrogels in CNS models and therapies.</a> Biotechnology Advances. , (2019).</li><li>Shany, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aragonite+crystalline+biomatrices+support+astrocytic+tissue+formation+in+vitro+and+in+vivo.">Aragonite crystalline biomatrices support astrocytic tissue formation in vitro and in vivo.</a> Tissue Engineering. 12 (7), 1763-1773 (2006).</li><li>Baranes, D., L&#243;pez-Garc&#237;a, J. C., Chen, M., Bailey, C. H., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+hippocampal+mossy+fiber+and+associational-commissural+pathways+in+a+novel+dissociated+cell+culture+system.">Reconstitution of the hippocampal mossy fiber and associational-commissural pathways in a novel dissociated cell culture system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4706-4711 (1996).</li><li>Peretz, H., Talpalar, A. E., Vago, R., Baranes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superior+survival+and+durability+of+neurons+and+astrocytes+on+3-dimensional+aragonite+biomatrices.">Superior survival and durability of neurons and astrocytes on 3-dimensional aragonite biomatrices.</a> Tissue Engineering. 13 (3), 461-472 (2007).</li><li>Shany, B., Vago, R., Baranes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+primary+hippocampal+neuronal+tissue+on+an+aragonite+crystalline+biomatrix.">Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix.</a> Tissue Engineering. 11 (3-4), 585-596 (2005).</li><li>Baranes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interconnected+network+of+ganglion-like+neural+cell+spheres+formed+on+hydrozoan+skeleton.">Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton.</a> Tissue Engineering. 13 (3), 473-482 (2007).</li><li>Morad, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gliosis+of+astrocytes+cultivated+on+coral+skeleton+is+regulated+by+the+matrix+surface+topography.">Gliosis of astrocytes cultivated on coral skeleton is regulated by the matrix surface topography.</a> Biomedical Materials. 14 (4), 045005 (2019).</li><li>Green, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Therapeutic+Potential+for+Marine+Skeletal+Proteins+in+Bone+Regeneration.">A Therapeutic Potential for Marine Skeletal Proteins in Bone Regeneration.</a> Marine Drugs. 11 (4), 1203-1220 (2013).</li><li>Neto, A. S., Ferreira, J. M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+and+Marine-Derived+Porous+Scaffolds+for+Bone+Tissue+Engineering.">Synthetic and Marine-Derived Porous Scaffolds for Bone Tissue Engineering.</a> Materials. 11 (9), (2018).</li><li>Ahmad Khalili, A., Ahmad, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Cell+Adhesion+Studies+for+Biomedical+and+Biological+Applications.">A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).</li><li>. Visualization of the ultrastructural interface of cells with the outer and inner-surface of coral skeletons Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19218486">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19218486</a> (2019)</li><li>Drake, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+skeletal+organic+matrix+from+the+stony+coral+Stylophora+pistillata.">Proteomic analysis of skeletal organic matrix from the stony coral Stylophora pistillata.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3788-3793 (2013).</li><li>Ramos-Silva, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+skeletal+proteome+of+the+coral+Acropora+millepora:+the+evolution+of+calcification+by+co-option+and+domain+shuffling.">The skeletal proteome of the coral Acropora millepora: the evolution of calcification by co-option and domain shuffling.</a> Molecular Biology and Evolution. 30 (9), 2099-2112 (2013).</li><li>Peretz, H., Blinder, P., Baranes, D., Vago, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aragonite+crystalline+matrix+as+an+instructive+microenvironment+for+neural+development.">Aragonite crystalline matrix as an instructive microenvironment for neural development.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2 (8), 463-471 (2008).</li><li>Morad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CaCO3 Matrix Dictates Astrocytes Transition to Astrogliosis. , (2019).</li><li>Prada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocean+warming+and+acidification+synergistically+increase+coral+mortality.">Ocean warming and acidification synergistically increase coral mortality.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li></ol>

Yazarlar, rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Burada sunulan teknik, kültürdeki sinir hücrelerinin bakımını ve işlevselliğini geliştirmenin bir yolunu açıklamaktadır. Bu, hücreleri, hücreleri besleyen ve büyümelerini ve aktivitelerini teşvik eden mercan iskelet tanelerinden yapılmış bir matrise yapıştırarak elde edilir. Bu tekniği kullanmak, nöral kültür modelinin beyindeki hücrelerin ortamını taklit etme kapasitesini arttırır.
Matrisin bir kültür substratı olarak tanıtılması, klasik nöral hücre kü...

Ayrışmış sinir hücrelerinin kültürleri, bu durumda hipokampal hücreler, yüksek hücre izolasyonu ve erişilebilirliği sağlayarak nöral büyümeyi ve işlevi incelemek için değerli bir deneysel modeldir 1,2,3. Bu tür bir kültür, büyüme ve canlılık oranları, nörotoksisite, nörit büyümesi ve ağ oluşturma, sinaptik bağlantı ve plastisite, morfolojik modifikasyonlar, nöritlerin organizasyonu ve kablolaması gibi toplanabilecek büyük miktarda bilgi nedeniyle nörobilim, ilaç geliştirme ve doku mühendisliğinde sıklıkla kullanılmaktadır.1,4,5,6,7.
Kültürlerin önemine rağmen, ekili hücreler genellikle iki boyutlu tek katmanlı cam örtüler üzerinde büyümeye zorlanır. Bu katı çevresel değişiklikler, sinir hücrelerinin zaman içinde hayatta kalma yeteneğini önemli ölçüde azaltır, çünkü cam örtüler, düşük yapışma mukavemetine sahip, hücre büyümesini desteklemek için daha düşük bir kapasite sergileyen, besleyici olmayan substratlardır 8,9,10,11.
Ekili sinir hücreleri zorlu koşullarda büyümeye zorlandığından, hayatta kalmalarını arttırmak için temel bir yaklaşım, doğal çevrelerini mümkün olduğunca taklit etmek olacaktır12,13. Bu, matris görevi görecek ve hücrelerin hücre dışı matrisini taklit edecek, doku benzeri bir yapı oluşturmalarını ve beslenmelerine yardımcı olmalarını sağlayacak biyomalzemeler kullanılarak başarılabilir14.
Biyomateryallerin kullanımı, hücre kültürlerinin iyileştirilmesinde umut verici bir yaklaşımdır, çünkü biyouyumlu iskeleler gibi davranırlar, mekanik stabilite sağlarlar ve yapışma, hayatta kalma, çoğalma, göç, morfogenez ve farklılaşma dahil olmak üzere çeşitli hücre özelliklerini arttırırlar15,16,17. İn vitro hücrelerin koşullarını iyileştirmek için çeşitli biyomateryal türleri kullanılır. Bunlar arasında biyopolimerler veya genellikle hücrelerin hücre dışı matrisinin bir parçası olan biyolojik bileşenler bulunur. Bu biyomalzemeler çoğunlukla polimerize kaplama ajanlarının veya hidrojellerin bir formu olarak kullanılır18,19,20. Bir yandan, yukarıda bahsedilen matrisler, hücrelere büyümeleri için tanıdık bir 3D ortam sağlar, çanağa yapışmalarını teşvik eder ve onlara mekanik destek verir21,22. Öte yandan, polimerize formları ve hücrelerin hidrojeller içinde hapsedilmesi, hücrelerin büyüme ortamında bulunan besleyici bileşenlere erişimini bozar ve ayrıca hücrelerin mikroskobik yöntemlerle takibini zorlaştırır23.
Mercan dış iskeletleri biyolojik deniz kaynaklı matrislerdir. Kalsiyum karbonattan yapılmış, mekanik stabiliteye sahip ve biyolojik olarak parçalanabilirler. Mercan iskeletini kültürde büyüyen sinir hücreleri için bir matris olarak kullanan önceki çalışmalar, cam örtükaymalarına kıyasla çok daha fazla yapışma göstermiştir 24,25. Ek olarak, mercan iskeleti üzerinde yetiştirilen nöral hücreler, iskeletin oluştuğu kalsiyumu alma yeteneklerini göstermiştir, bu da sinir hücrelerini besin yoksunluğu koşullarında korur26. Dahası, mercan iskeleti, sinir hücrelerinin hayatta kalmasını artıran, sinir ağlarının oluşumunu teşvik eden, sinaptik bağlantı oranını yükselten ve doku benzeri yapıların oluşumunu sağlayan destekleyici ve besleyici bir matristir27,28. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, mercan iskelet matrisinin yüzey topografyasının glial hücrelerin dağılımında ve aktivasyonunda çok önemli bir rol oynadığını göstermiştir 8,29. Ayrıca, mercan iskeleti, osteositler30,31, hepatositler ve kültürdeki kardiyomiyositler gibi diğer hücre tiplerinin yetiştirilmesi için bir matris olarak etkilidir (yayınlanmamış veriler).
Bu nedenle, mercan iskeleti, in vitro hücrelerin yetiştirilmesi için umut verici bir matristir. Bu nedenle, aşağıda ayrıntılı olarak açıklanan protokol, mevcut yöntemlerle elde edilenlerden daha kararlı ve müreffeh sinir kültürleri üretmek için mercan iskeleti üzerindeki sinir hücrelerini yetiştirme tekniğini açıklamaktadır. Bu protokol ayrıca kardiyomiyositlerin, hepatositlerin ve diğer hücre tiplerinin yetiştirilmesi için de yararlı olabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>#60-662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D &#8211; glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Minimal Essential Eagle (DMEM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical sieve</td>
			<td>Ari Levy</td>
			<td>#3700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serun (FBS)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>#04-007-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>First Day Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>85.1% Minimum Essential Eagle&#8217;s medium (MEM), 11.5% heat-inactivated fetal bovine serum, 1.2% L-Glutamine and 2.2% D-Glucose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>#60-690160</td>
			<td>25cm^2, Tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-deoxy-uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslips</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>#BNCB00120RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Romical</td>
			<td>#007130-72-19</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mixture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#N4888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HANK&#39;S solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#K3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L - glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual strainer (40&#181;m)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#10199-654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimun Essential Eagle (MEM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#M2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and pestle</td>
			<td>De-Groot</td>
			<td>4-P090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaClO (Sodium Hypochlorite)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#425044</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#S8045</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuronal Growth Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>45% MEM, 40% Dulbecco&#39;s modified eagle&#39;s medium (DMEM), 10% Nutrient mixture F-12 Ham, 0.25% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.75% D-glucose, 0.25% L-Glutamine, 0.5% B-27 supplement, 0.1% kynurenic acid, 0.01% of 70 % uridine and 30% fluoro-deoxy-uridine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>#60-628160, #60-627160</td>
			<td>60mm, 35mm, respectively.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly D &#8211; Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smart Dentin Grinder</td>
			<td>KometaBio</td>
			<td>#GR101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#15-090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#U3750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

increasing durability of dissociated neural cell cultures using biologically active coralline matrix

Ayrışmış hipokampal, nöronal ve glial hücrelerin kültürleri, yüksek hücre izolasyonu ve kontrollü bir ortam sağlayarak nöral büyümeyi ve fonksiyonu incelemek için değerli bir deneysel modeldir. Bununla birlikte, hipokampal hücrelerin in vitro olarak hayatta kalması tehlikeye girer: çoğu hücre kültürün ilk haftasında ölür. Bu nedenle, kültürdeki sinir hücrelerinin dayanıklılığını arttırmanın yollarını belirlemek büyük önem taşımaktadır.
Mercanların iskeletinden elde edilen kristalin aragonit formundaki kalsiyum karbonat, nöral kültürler için üstün, aktif bir matris olarak kullanılabilir. Glial hücreleri besleyerek, koruyarak ve aktive ederek, mercan iskeleti bu hücrelerin hayatta kalmasını ve büyümesini in vitro olarak diğer matrislerden daha iyi arttırır.
Bu protokol, bir mercan matrisi üzerinde hipokampal hücrelerin yetiştirilmesi için bir yöntem açıklar. Bu matris, mercan iskeletlerinin tanelerinin kültür yemeklerine, şişelere ve cam örtülere bağlanmasıyla üretilir. Tahıllar, hücrelerin ortamını, büyümek ve doku benzeri yapılar oluşturmak için ince bir üç boyutlu (3B) ortama sokarak iyileştirmeye yardımcı olur. Mercan iskeleti tarafından tanıtılan 3D ortam, glial hücrelerin aktivitesini etkilediği tespit edilen bir özellik olan taneciklerin büyüklüğü ve yoğunluğu (yani, matris pürüzlülüğü) üzerinde kontrol sağlayan öğütme yoluyla hücreler için optimize edilebilir. Dahası, tahıl kullanımı, özellikle ışık mikroskobu kullanıldığında, kültürlerin gözlemlenmesini ve analizini kolaylaştırır. Bu nedenle, protokol, in vitro sinir hücrelerinin bakımını ve işlevselliğini geliştirmek için bir araç olarak mercan matrisinin oluşturulması ve optimizasyonu için prosedürler içerir.

Mercan iskelet matrisini hazırlamak için, tüm mercan iskeleti (Şekil 1A) bir çekiç kullanılarak 0,5-2 cm'lik parçalara ayrıldı (Şekil 1B) ve% 10 hipoklorit çözeltisi, 1M NaOH çözeltisi ve% 30H2O2çözeltisi (Şekil 1C) kullanılarak üç adımda (protokolde adım 1) organik artıklardan iyice temizlendi. İskelet rengi kahverengiden (Şekil 1D) beyaza (<strong class=...

Watch this Scientific Journal Video about Increasing Durability of Dissociated Neural Cell Cultures Using Biologically Active Coralline Matrix at JoVE.com

Increasing Durability of Dissociated Neural Cell Cultures Using Biologically Active Coralline Matrix

Ayrışmış hipokampal hücre kültürü, nörobilimde çok önemli bir deneysel araçtır. Nöroprotektif ve nöromodülatif rolleri nedeniyle mercan iskeletleri matris olarak kullanıldığında kültürde nöral hücre sağkalımı ve fonksiyonu artar. Bu nedenle, mercan matrisinde yetiştirilen nöral hücreler daha yüksek dayanıklılık gösterir ve bu nedenle kültürleme için daha yeterlidir.

Biyolojik Olarak Aktif Mercan Matrisi Kullanılarak Ayrışmış Nöral Hücre Kültürlerinin Dayanıklılığının Arttırılması

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high ...

increasing-durability-dissociated-neural-cell-cultures-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

1.2K Görüntüleme.  Ariel University. Ayrışmış hipokampal hücre kültürü, nörobilimde çok önemli bir deneysel araçtır. Nöroprotektif ve nöromodülatif rolleri nedeniyle mercan iskeletleri matris olarak kullanıldığında kültürde nöral hücre sağkalımı ve fonksiyonu artar. Bu nedenle, mercan matrisinde yetiştirilen nöral hücreler daha yüksek dayanıklılık gösterir ve bu nedenle kültürleme için daha yeterlidir.

Video: Increasing Durability of Dissociated Neural Cell Cultures Using Biologically Active Coralline Matrix

Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications. Briefly, decellularized tissue is lyophilized, milled, enzymatically digested, and then brought to physiological pH. The lyophilization removes all water content from the tissue, resulting in dry ECM that can be ground into a fine powder with a small mill. After milling, the ECM powder is digested with pepsin to form an injectable matrix. After adjustment to pH 7.4, the liquid matrix material can be injected into the myocardium. Results of previous characterization assays have shown that matrix gels produced from decellularized pericardial and myocardial tissue retain native ECM components, including diverse proteins, peptides and glycosaminoglycans. Given the use of this material for tissue engineering, in vivo characterization is especially useful; here, a method for performing an intramural injection into the left ventricular (LV) free wall is presented as a means of analyzing the host response to the matrix gel in a small animal model. Access to the chest cavity is gained through the diaphragm and the injection is made slightly above the apex in the LV free wall. The biologically derived scaffold can be visualized by biotin-labeling before injection and then staining tissue sections with a horse radish peroxidase-conjugated neutravidin and visualizing via diaminobenzidine (DAB) staining. Analysis of the injection region can also be done with histological and immunohistochemical staining. In this way, the previously examined pericardial and myocardial matrix gels were shown to form fibrous, porous networks and promote vessel formation within the injection region.

Methods for preparing an injectable matrix gel from decellularized tissue and injecting it into rat myocardium in vivo are described.

Miyokard Doku Mühendisliği Biyolojik Türetilmiş Enjektabl Malzeme imalatı

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

Biyomühendislik

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent shape upon the application of a stimulus such as heat1-5. In a typical shape memory cycle, the SMP is first deformed at an elevated temperature that is higher than its transition temperature, Ttrans [either the melting temperature (Tm) or the glass transition temperature (Tg)]. The deformation is elastic in nature and mainly leads to a reduction in conformational entropy of the constituent network chains (following the rubber elasticity theory). The deformed SMP is then cooled to a temperature below its Ttrans while maintaining the external strain or stress constant. During cooling, the material transitions to a more rigid state (semi-crystalline or glassy), which kinetically traps or "freezes" the material in this low-entropy state leading to macroscopic shape fixing. Shape recovery is triggered by continuously heating the material through Ttrans under a stress-free (unconstrained) condition. By allowing the network chains (with regained mobility) to relax to their thermodynamically favored, maximal-entropy state, the material changes from the temporary shape to the permanent shape.
Cells are capable of surveying the mechanical properties of their surrounding environment6. The mechanisms through which mechanical interactions between cells and their physical environment control cell behavior are areas of active research. Substrates of defined topography have emerged as powerful tools in the investigation of these mechanisms. Mesoscale, microscale, and nanoscale patterns of substrate topography have been shown to direct cell alignment, cell adhesion, and cell traction forces7-14. These findings have underscored the potential for substrate topography to control and assay the mechanical interactions between cells and their physical environment during cell culture, but the substrates used to date have generally been passive and could not be programmed to change significantly during culture. This physical stasis has limited the potential of topographic substrates to control cells in culture.
Here, active cell culture (ACC) SMP substrates are introduced that employ surface shape memory to provide programmed control of substrate topography and deformation. These substrates demonstrate the ability to transition from a temporary grooved topography to a second, nearly flat memorized topography. This change in topography can be used to control cell behavior under standard cell culture conditions.

A method for developing cell culture substrates with the ability to change topography during culture is described. The method makes use of smart materials known as shape memory polymers that have the ability to memorize a permanent shape. This concept is adaptable to a wide range of materials and applications.

Aktif Hücre Kültürü Şekil Bellek Polimerler

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level. However, this is not easily achieved because the small amount of labile mRNA present in a single cell (1-5% of 1-50pg total RNA, or 0.01-2.5pg mRNA, per cell 1) mostly degrades before it can be reverse transcribed into a stable cDNA copy. For example, using standard laboratory reagents and hardware, only a small number of genes can be qualitatively assessed per cell 2. One way to increase the efficiency of standard laboratory reverse transcriptase (RT) reactions (i.e. standard reagents in microliter volumes) comprising single-cell amounts of mRNA would be to more rapidly mix the reagents so the mRNA can be converted to cDNA before it degrades. However this is not trivial because at microliter scales liquid flow is laminar, i.e. currently available methods of mixing (i.e. shaking, vortexing and trituration) fail to produce sufficient chaotic motion to effectively mix reagents. To solve this problem, micro-scale mixing techniques have to be used 3,4. A number of microfluidic-based mixing technologies have been developed which successfully increase RT reaction yields 5-8. However, microfluidics technologies require specialized hardware that is relatively expensive and not yet widely available. A cheaper, more convenient solution is desirable. The main objective of this study is to demonstrate how application of a novel "micromixing" technique to standard laboratory RT reactions comprising single-cell quantities of mRNA significantly increases their cDNA yields. We find cDNA yields increase by approximately 10-100-fold, which enables: (1) greater numbers of genes to be analyzed per cell; (2) more quantitative analysis of gene expression; and (3) better detection of low-abundance genes in single cells. The micromixing is based on acoustic microstreaming 9-12, a phenomenon where sound waves propagating around a small obstacle create a mean flow near the obstacle. We have developed an acoustic microstreaming-based device ("micromixer") with a key simplification; acoustic microstreaming can be achieved at audio frequencies by ensuring the system has a liquid-air interface with a small radius of curvature 13. The meniscus of a microliter volume of solution in a tube provides an appropriately small radius of curvature. The use of audio frequencies means that the hardware can be inexpensive and versatile 13, and nucleic acids and other biochemical reagents are not damaged like they can be with standard laboratory sonicators.

We describe a novel method for increasing cDNA yield from single-cell quantities of mRNA in otherwise standard laboratory reverse transcription reactions. The novelty resides in the use of a micromixer, which utilizes the phenomenon of acoustic microstreaming, to mix fluids at microliter scales more effectively than shaking, vortexing or trituration.

Akustik Microstreaming kullanarak Standart Laboratuvar Reverse Transcriptase reaksiyonlarda mRNA Tek hücreli Miktarları cDNA Verim artırılması

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Raman Spektroskopisi kullanarak Hücreler ve Ekstrasellüler Matriks Temassız, Etiket ücretsiz izleme

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Shock Wave Application to Cell Cultures

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to target cells or tissue without any subsequent damage. Therefore, in vitro experiments are of increasing interest. Various methods of applying shock waves onto cell cultures have been described. In general, all existing models focus on how to best apply shock waves onto cells.
However, this question remains: What happens to the waves after passing the cell culture? The difference of the acoustic impedance of the cell culture medium and the ambient air is that high, that more than 99% of shock waves get reflected! We therefore developed a model that mainly consists of a Plexiglas built container that allows the waves to propagate in water after passing the cell culture. This avoids cavitation effects as well as reflection of the waves that would otherwise disturb upcoming ones. With this model we are able to mimic in vivo conditions and thereby gain more and more knowledge about how the physical stimulus of shock waves gets translated into a biological cell signal (&#8220;mechanotransduction&#34;).

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Therefore in vitro experiments are of increasing interest. We therefore developed a model for in vitro shock wave trials (IVSWT) that enables us to mimic in vivo conditions thereby avoiding distracting physical effects.

Kültürler Hücre Şok Dalga Uygulama

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

Geliştirilmiş 3D hidrojel Neuroinflammation Vitro modelleme için birincil gliyal hücreler kültürleri

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.

Büyük Tendon Kusurlarını Onarmak İçin Doku Mühendisliği Kollajen Greftli Yeni Bir Tenorhaphy Dikiş Tekniği

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Bir böbrek korteks ekstraselüler matrisi elde edilen hidrojel imalatı

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure and healing. Extraction of extracellular matrix from fibrogenic cell cultures in vitro has potential for generation of ECM from human- and potentially patient-specific cell lines, minimizing the presence of xenogeneic epitopes which has hindered the clinical success of some existing ECM products. A significant challenge in in vitro production of ECM suitable for implantation is that ECM production by cell culture is typically of relatively low yield. In this work, protocols are described for the production of ECM by cells cultured within sacrificial hollow fiber membrane scaffolds. Hollow fiber membranes are cultured with fibroblast cell lines in a conventional cell medium and dissolved after cell culture to yield continuous threads of ECM. The resulting ECM fibers produced by this method can be decellularized and lyophilized, rendering it suitable for storage and implantation.

The goal of this protocol is production of whole extracellular matrix fibers targeted for wound repair which are suitable for preclinical evaluation as part of a regenerative scaffold implant. These fibers are produced by the culture of fibroblasts on hollow fiber membranes and extracted by dissolution of the membranes.

Hücre dışı matriks liflerinin kurban Hollow Fiber membran hücre kültürü ile üretim

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...