Bu protokol kültürlü hücre hatlarından dökme ekstrasellüler matris filamentler üretimi için izin verir, hücre matris etkileşimleri içine araştırma için izin, yanı sıra yara onarımı için bu biyomalzemenin potansiyeli içine araştırma. Bu sentetik lifler sentetik malzemelere karşı yöneltilen yabancı cisim tepkisini önleyebilir, tekstil üretim tekniklerinin zengin repertoiresinden çizim yaparken çok çeşitli dokuma implante edilebilirler oluşturabilir. Prosedürü gösteren Cassandra Reed, benim laboratuarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olacak.
Hücreleri tohumlamadan önce, içi boş lif zarlarını 30 dakika boyunca 121 derecede otoklavlayın, ardından PBS'de 50 mililitre büyükbaş plazma fibronektin ile bir saat boyunca %5 karbondioksitte 37 santigrat derece. Kuluçka sonunda, altı santimetre veya daha az lifleri kesmek için steril mikro makas kullanın, ve bir mililitre şırınga bir kez tohum için 21 gauge iğne ile donatılmış kullanın 10 beşinci fibroblast hücreleri doğrudan içi boş lif zarlarının lumina içine. Altı inç çapında Petri çanak içine altı tohumlu lifler yerleştirin ve kısaca% 5 karbondioksit 37 santigrat derece tohumlu lifler inkübün.
Beş dakika sonra, l-askorbik asit ile takviye fibroblast kültür orta içeren yeni bir altı santimetre Petri çanak içine kuvöz lifleri aktarın, L-askorbik asit 2 fosfat, ve hücre kültürü kuluçka üç hafta için büyüme faktörü beta 1 dönüştürme. Kuluçka sonunda, forceps o bireysel scintillation şişeleri içine kültürlü lifleri aktarmak ve her şişe tilt beş mililitre N-Metil-2-pyrrolidone kadar ilave şişelerin yan aşağı izin vermek. Sonra yavaş yavaş her lif N-Metil-2-pyrrolidone aspire için bir serolojik pipet kullanın, ve taze N-Methyl-2-pyrrolidone ikinci bir daldırma için yeni scintillation şişeleri içine lifleri aktarın.
Üçüncü daldırma sonra, benzer bir şekilde deiyonize suda ortaya çıkan ekstrasellüler matris iplikleri üç kez durulayın ve standart bir üç-by-one inç cam mikroskop slayt üzerine merkezi sekiz-by-dört milimetre dikdörtgen kalıp ile silikon kauçuk üç inç uzunluğunda, bir inç genişliğinde 1/23rd-inç kalınlığında parça yerleştirin. Otoklavlama dan sonra, görünür açık alan olana kadar sekiz ila dört milimetrelik silikon kalıbın ait her bir ekstrasellüler matriks lifini yan yana yatırın. 50 mililitrelik konik tüp içine kalıp yerleştirin ve tamamen dondurulmuş kadar negatif 80 santigrat derece lifleri dondurun.
Decellularization için, nazik ajitasyon ile bir rocker oda sıcaklığında 24 saat boyunca% 1 sodyum dodecyl sülfat kalıp kuluçka. Ertesi gün, yıkama başına PBS üç mililitre üç yıkar ile çıkarılan ekstrasellüler matris durulayın ve dört derece santigrat altı saatlik kuluçka için taze hazırlanmış DNA / RNA sindirim tampon ile kalıp doldurun. Sindirim sonunda, sindirim çözeltisi aspire ve steril PBS olarak gösterdiği gibi üç kez kalıp durulayın.
Üçüncü yıkamadan sonra, yaklaşık bir saat boyunca negatif 80 santigrat derecede 50 mililitrelik konik tüp donma önce dört derece Santigrat bir gecede PBS% 10 Penisilin-Streptomisin iskeleler inkübün. Mesh tamamen donduğunda, bir gecede hücre dışı ağ lıfilat, ya da tamamen kuruyana kadar, ve bir biyo güvenlik başlığı içinde steril bir konteyner için lyophilized iskeleler aktarın ve kullanıma kadar dört derece santigrat de saklamak. Burada bu protokol kullanılarak imal edilen bir polisülfon içi fiber membranın enine kesiti gösterilmektedir, asimetrik membran karakteristik parmak benzeri gözenekleri dış ve iç katmanları sergileyen.
Fibroblast hücre fidesi ve kültüründen sonra, gösterildiği gibi N-Metil-2-pyrrolidone durulama, hücre dışı matriks yarı saydam iplikler üretilir. Hücre dışı matriks üreten hücreler tüm üç haftalık kültür dönemi boyunca içi boş lif zarları içinde canlı kalır. Çıkarılan matris sulu bir yarı saydam bir görünüme sahiptir, örgü montaj ve lyophilization üzerine brüt uzunlamasına hizalama ile bir off-beyaz renk ve lifli bir görünüm sergileyen.
En kritik adım, hücre dışı matriks çıkarmak için N-Metil-2-pyrrolidone çözücü kültürlü içi boş lif zarlarının eritme işlemidir. Bu yöntemle üretilen malzeme, klinik öncesi çalışmalarda dokuların onarımını araştırmak için doku mühendisliği implantlarının imalatında kullanılabilir. Bu protokolde kullanılan N-Metil-2-pyrrolidone bir deri ve göz tahriş edici, ve bu nedenle nitril eldiven, gözlük, bir laboratuvar ceket kullanarak kimyasal ele önerilir, ve bir duman başlık içinde ele.
