Bu yöntem, hücre matris etkileşimlerinin sülfatı nasıl etkilediği gibi biyomalzemeler alanındaki temel soruların yanıtlatına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, doğal böbrek korteks biyokimyasal mikro ortamlarını doğru bir şekilde yansıtan ilk malzemeyi üretmesidir. Bir doku kültürü başlığı bir yastık altında ile çizgi.
Bir karıştırma çubuğu içeren bir litrelik beher yerleştirin, bir 150 milimetre steril doku kültür çanak, ve kaputun içine tüm böbrek. Kabı %1 SDS çözeltisinin 500 mililitresi ile doldurun. Steril doku kültür çanak böbrek yerleştirin.
Bir neşter ile böbrek kapsülü etrafında hafifçe tıraş tarafından tüm perirenal yağ çıkarın. Sonra, altta yatan korteks dokusuna zarar vermeden böbrek kapsülü açmak için, böbrek üstün ucunda sığ bir 8 ila 10 santimetrelik bir kesi yapmak. Korteks dokusundan soyurarak böbrek kapsülü kaldırmak için iki hemostat kelepçekullanın.
Böbreğin yan tarafı boyunca neşter kullanarak koronal düzlem boyunca böbreği ikiye ayırın. Neşter bölgeyi neşterle oyarak korteks dokusunu her iki yarıdan ayırın. Sonra, 0.5 santimetre küp parçalar halinde korteks dokusu zar ve herhangi bir büyük, görünür damarları kaldırın.
Böbrekten ekstrasellüler matriks izole etmek için, sds çözeltisi içeren beher içine doğranmış korteks dokusu yerleştirin. Otoklavlı alüminyum folyo ile kaplayın ve doku kültürü başlık dışında, yaklaşık 400 RPM bir karıştırma plakası üzerine yerleştirin. Karıştırma 24 saat sonra, bir doku kültürü başlık içine beher getirmek.
Naylon örgü ile yapılan 40 mikron steril hücreli süzgeç ekleyin. Ve sonra, 1000 mililitrelik ayrı bir kabı 200 mililitre çamaşır suyuyla doldurun ve doku kültürüne yerleştirin. SDS çözeltisini hücre süzgecinden geçirerek çamaşır suyu içeren kabın içine atın.
Kalan SDS çözeltisini sadece hücredışı doku ve hücre süzgeci kabında kalana kadar dışarı çıkar. Hücre süzgecini kabın içinde bırakın ve 500 mililitre taze SDS çözeltisi ekleyin. Aynı alüminyum folyo ile kaplayın ve daha önce aynı hızda bir karıştırma plakası üzerine yerleştirin.
Hücredışılaştırma ve yıkamadan sonra, bu noktadan itibaren böbrek ECM olarak adlandırılan hücredışı doku, 30 mililitrelik kendi kendine duran konik tüp içine transfer. Ve tüm doku lar sular altında kalana kadar hücre kültürü sınıfı suyla doldurun. İlk olarak, konik tüpte böbrek ECM homojenize etmek için bir doku homogenizer kullanın, ECM görünür parçaları ile opak bir çözüm elde edilene kadar.
Daha sonra, tüp çevreleyen kaynama kadar sıvı azot böbrek ECM içeren konik tüp batırın artık devam eder. Böbrek ECM'sini bir gecede eksi 4 derecede saklayın. Dondurulmuş hücreli doku lyophilize için, biraz gaz değişimi için izin konik tüp kapağı gevşetin, ve bir lyophilization makineiçine tüp yerleştirin.
Üç gün boyunca böbrek ECM lyophilize, ya da ince, beyaz toz benzeyene kadar. Kimyasal sindirmek ve jel solubilize etmek için, dikkatle tartılmış domuz mide pepsin ekleyin, ve 0.01 bir scintillation aşağılık bir scintillation için bir scintillation bar içeren. Tüm pepsin eriyene kadar, yaklaşık 500 RPM karıştırın.
Daha sonra, sintillation aşağılık lyophilized böbrek ECM aktarın ve stok böbrek ECM hidrojel yapmak için üç gün boyunca yaklaşık 500 RPM bir karıştırma plakası üzerinde çözüm bırakın. Bir doku kültürü başlık olarak, steril bir 30 mililitre lik kendi kendine ayakta konik tüp içine hücre kültürü medya, bir normal sodyum hidroksit ve M199 takviyesi gerekli hacimlerde pipet. Nötralize reaktif çözeltisini mikro spatula ile karıştırın.
Nötralize reaktif çözeltisi stok böbrek ECM hidrojel uygun hacmi aktarmak için steril bir mililitre şırınga kullanın. Homojen bir renk, hidrojel çözeltisi elde edilene kadar çözeltiyi nazikçe karıştırmak için mikro spatula kullanın. Yavaş ve yavaşça karıştırarak hava kabarcıkları tanıtmakkaçının.
Böbrek ECM hidrojel içine hücreleri dahil etmek için, her hidrojel için orta 10 mikrolitre üç yüz bin hücreleri resuspend. Pipet 10 mikrolitre hücre süspansiyonu son böbrek ECM jeline. Hücreler eşit dağıtılana kadar bir mikro spatula ile çözelti yikarıştırın.
Böbrek ECM hidrojel ile istenen hücre kültürü cihazı doldurmak için bir mililitre şırınga kullanın. Hücre kültürü cihazında hücreleri böbrek ECM'sine aktarmadan veya kaplamadan önce jelin bir saat boyunca 37 santigrat dereceye ayarlanın. Kütle spektrometresi ile hücreli korteks dokusunun analizi, fesleğen lamina ile ilişkili proteinlerin varlığını ortaya koymuştur, Kollajen-IV ve Kollajen-I en yüksek temsil olmak.
Kollajen-IV, A1 ve A2 zincirleri, tüm bazal membranlarda korunmuştur. Glomerulusun sadece bazal membranlarında bulunan kollajen-IV, A3 ve A5 zincirleri de saptandı. Laminalar ve Kollajen-I'nin ortak izo formları da tespit edildi.
İnsan böbrek peritubüler mikrovasküler endotel hücreleri, veya HKMECs, Kollajen-I kültürlü, böbrek ECM, ve 1:1 karışım jel, fenotip farklılıkları gösterdi. Kollajen-I'de kültürlenen HKMEC'ler, kırmızı renkte görülen tek tip CD31 ifadesini sergilediler. HKMECs böbrek ECM içeren iki jel kültürlü iken, düzensiz dağılımlarda azaltılmış CD31 ifadesi görüntülenir.
Matris türü, yeşil renkle gösterilen VWF ifadesini etkilemiyor. Bu işlemi denerken, tamamen hücreleşmiş böbrek korteks dokusu homojenize hatırlamak önemlidir. Ayrıca, nötralize reaktifler ile jel karıştırırken, hava kabarcıkları giriş kaçının.
Mikro fizyolojik sistemler kontrollü bir laboratuvar ortamında organ fonksiyonunun incelenmesine olanak sağlar. Bu tür sistemlerin oluşturulması hücrelerin, matrislerin ve uyaranların uygulanmasını gerektirir. Burada üretilen kECM hidrojel, böbrek mikro ortamlarını özetleyen sistemleri incelememize olanak sağlayacaktır.
