Biz pLPCX-Histon H2-GFP plazmid sağlamak için S. Taylor minnettarız. Biz sürekli destek için R. Mertelsmann ederim. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft tarafından desteklenmiştir.

1. Mikroskop Odası Slaytlar üzerindeki U2OS tabanlı Siklin B-SNAP Reporter Hücreleri (Klon 11 Hücreler 6) Tohum <ol><li> En az 48 saat süreyle günlük aşamada uyumsuz büyümeye izin verildi subconfluent SNAP muhabiri hücreleri Trypsinize. </li><li> 8 sıra mikroskop odaları (hücre sabiti dağıtımı) ile çalışma. </li></ol> Mikroskop bölmesinin bütün yüzey, santrifüj 10,000 hücreler boyunca sabit bir dağıtım az 8 iyi mikroskop odaları üzerine hücre tohumlama ve kırmızı fenol içermeyen normal büyüme ortamının 350 ul (% 10 fetal bovin serumu, penisilin / streptomisin ile takviye içinde tekrar süspansiyon için ve sodyum piruvat). Mikroskop odası (Şekil 2) hücre süspansiyonu aktarın. 8 sıra mikroskop odaları (merkezi maksimum hücre yoğunluğu) ile çalışma. Mikroskop chamb merkezinde daha yüksek bir yoğunlukta hücreler tohumlanması içiner, fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme orta 300 ul odasına yerleştirin. Mikroskop odası merkezi (Şekil 2) dikkatlice 5.000 hücreleri ekleyin. 96 özel optik levhalar (hücre sabiti dağıtımı) ile çalışma. De, tüm yüzeyi boyunca sürekli bir dağılımı 96 kuyucuğu üzerine hücrelerin tohumlama için 5.000 hücreler santrifüj ve fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme orta 300 ul tekrar süspansiyon haline getirin. 96 çukurlu bir levha için hücre süspansiyonu aktarın. Gerekli hücre içeren kuyu toplam sayısına bağlı olarak, hücre sayısı ve süspansiyon ortamının toplam hacmi (Şekil 2) ayarlayın. 96 özel optik levhalar (merkezinde maksimum hücre yoğunluğu) ile çalışma. 96 plakalar üzerine hücre ekimi için, dikkatli bir smal fenol red-free normal büyüme orta 15 ul 1.500 hücreleri ekleyiniyi merkezi (Şekil 2) ile hücre büyümesini sınırlandıran elde etmek için her bir kuyucuğa merkezine l damla. <ol start="3"><li> Çekirdekli hücreleri standart hücre kültür koşullarında (37 ° C,% 100 nem,% 5 CO2) altında en az 18 saat süreyle büyümesine izin verin. </li></ol> 2. SNAP Substrat ile Muhabir Hücrelerin boyanması <ol><li> Öncesinde boyama işlemi başına 30 dk fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme orta alikotları 37 kadar ısınmasını bekleyin ° C </li><li> SNAP yüzey işlemesini kolaylaştırmak için (bizim durumumuzda TMR Star) -20 ° C&#39;de saklanabilir 400 mcM stok solüsyonu, bir konsantrasyon elde etmek DMSO TMR Yıldızlı çözülür </li><li> Boyamadan önce, 1 uM&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek için etiketleme fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamı (37 ° C) 200 ul içinde TMR Yıldız stok çözeltinin 0.5 ul seyreltin. </li><li> Uyumsuz büyüyen hücrelerin normal büyüme ortamı çıkarın ve l inkübestandart kültür koşulları altında 25 dakika boyunca ortam abeling. </li><li> Fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamı (37 ° C) ile orta ve yıkama hücreleri dört kez etiketleme çıkarın. 30 dakika için fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamı (37 ° C) 300 ul hücre inkübe edin. Önce mikroskop taşımadan rezidüel ilişkisiz SNAP substrat kaldırmak için taze fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamı (37 ° C), orta değiştirin. </li><li> Bir önceden ısıtılmış bir styrofoam kutu içinde mikroskop için Aktarım hücreleri (37 ° C) sıcaklık değişimi en aza indirgemek için ısı blok. </li></ol> 3. Floresan Yoğunluğu Ölçümü <ol><li> Önceki analiz için iki saat ° C kuru modunda istenilen sıcaklık bütün bileşenleri ile tüm mikroskop getirmek için 37 iklim odasının hava sıcaklığını ayarlamak. Ön ısıtma nem ayarlamadan önce mikroskop yoğuşma ve sonraki hasarı önlemek için önemlidir. </li><li> Hava nemi t ayarlayıno% 60 ve analiz başlangıç ​​önce CO 2-5%. </li><li> Tarama ^ R Toplama yazılımını başlatın ve standart ayarlar (bkz. Tablo 1) tanımlayabilirsiniz. </li><li> Analiz edilecek kuyuların konumlarını tanımlayın. </li><li> Dt (iktisap çevrim süresi) ve iktisap döngüleri mutlak sayısını tanımlayın. </li><li> Kuyuların daha yüksek bir dizi analizi istenirse, donanım otofokus seçmek, aksi halde tek başına yazılım otofokus kullanmak için yeterlidir. </li><li> Edinimi başlatın ve ilk iki satın alma döngüsü için denetleyecek. Filtre değiştirilir ve buna karşılık gelen görüntü TMR Yıldız (Şekil 3) elde edilir önce mikroskop bu kanal içinde bir birinci görüntü sonraki toplama ile, histon H2-GFP sinyali üzerine odaklanacaktır. Bu tekrar sonraki döngüsü tekrarlanmadan önce, iyi içinde ve incelenmesi gereken kuyuların her biri için tüm pozisyonlar için tekrarlanır. </li></ol> 4. Proteolitik Profiller u analiziTarama ^ R şarkı <ol><li> Tarama ^ R Analiz yazılımını başlatın ve hücre çekirdekleri ile görüntüleri analiz olarak sinyal şiddeti ve komşu hücreleri ayıran yardımcı olmak için bir dönüm algoritmasına dayanan bir eşik kullanarak, ana nesne olarak tanımlanan histon H2-GFP, gözlemlenmiştir. Sitoplazma ile bir çekirdek içeren bir subobject TMRstar analiz için oluşturulmalıdır. (Ana nesne Önemli özellikleri X ve Y konumlarını, saat ve maksimum ve ana nesne ve TMRstar altnesnesi için alanına bölünmesiyle toplam yoğunluğunun GFP yoğunluklarını demek.) Bu analiz işlem büyük veri nedeniyle birkaç saat sürebilir miktarları. </li><li> Analiz ana nesneleri (Şekil 4) atanan zamanla altnesnesi ortalama TMR Yıldızlı floresan yoğunluğu (hücre izleri), görselleştirmek modu iz değiştirin. Incelenmesi gereken hücre sayısı en az 140 devir süren bu ölçümlere gating ile ve H2-GFP yüksek bir maksimum yoğunluğu ile daralmış olabilir. Lookinghücrelerin daha fazla sayıda bir ilk temsilcisi ve objektif bakış (Şekil 4) sağlar. </li><li> Tek hücre düzeyinde (Şekil 5A) aynı anda histon H2-GFP ve TMR Yıldızlı floresans görselleştirmek için ilgi bir hücre iz seçin. </li><li> Ilgi bir hücre üzerinde sağ klik kullanarak ve histon H2-GFP ve siklin B-SNAP her zaman noktası için TMR Star illüstrasyon için verilebilir bir resim galerisi oluşturmak. </li><li> Tarama ^ R Analiz yazılımı ve kapısı ilgi hücresi X vs Y nokta arsa (Şekil 5B) temsil edilmektedir bölgenin nüfusu moduna değiştirin. </li><li> Geçitli bölgeye yeni bir nokta çizim penceresinde Uygula ve zamanla TMR Yıldızlı floresan yoğunluğu (Şekil 5C) demek görselleştirmek. </li><li> Daha fazla hesaplama için Microsoft Excel İhracat verileri (zaman ve floresan yoğunluğu). </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Incirure 5D ve 5E bir hücre bir TMR Yıldız floresans yoğunluk eğrisi ile temsil siklin B kinetiği, Resmedeceğiniz kromozomal kayma belirtileri (Şekil 5E) olmadan normal mitoz yoluyla ilerler. Hücre prometafaz 6 girdiğinde izomorf penceresi (diyagramdaki parlak bölge) ulaşılana kadar nükleer zarf dökümü (NEBD gibi kırmızı üçgen ile gösterilir) takiben sitoplazma sıkıştırma üzerine, TMR Yıldızlı floresan yoğunluğu ani bir artış gösterir. Floresan yoğunluğu profaz ve metafaz hücre aracılığıyla ilerledikçe sürece istikrarlı bir düzeyde kalır ve daha sonra tüm kromozomlar (Şekil 5D ve 5E) istikrarlı bir metafaz plakası kurduk sonra hızla düşmeye başlar. Bu düşüş anafaz (eğri üzerinde mavi nokta) sırasında kromozom ayırma önce gelir. Geç mitoz yılında kromatin decondense başlar (mavi çubuk) ve floresan yoğunluğu eğrisi yaklaştığında ise hücre interfaz morfolojisi benimsermitoz (Şekil 5D ve 5E) önce plato daha düşüktür plato. <table border="1"><tbody><tr><td> Otofokus ayarları </td><td> Histon H2-GFP (ana nesne toplama ayarları) </td><td> TMR Yıldız ile etiketlenmiş Siklin B-SNAP (Satın alma ayarları) </td><td> Toplama döngü süresi Tekrarlar </td></tr><tr><td> Kaba otofokus + / -39 mikron 24 Katmanlar Güzel otofokus + / -5.4 Mikron 14 Katmanlar </td><td> GFP filtresi ayarlayın: Pozlama süresi: 100 ms Işık yoğunluğu: 25% </td><td> TRITC filtre ayarlayın: Pozlama süresi: 150 ms Işık yoğunluğu: 33.3% </td><td> 2-5 dk. </td></tr><tr><td> GFP filtresi ayarlayın: Pozlama süresi: 12 ms Işık yoğunluğu:% 12.5 </td><td></td><td></td><td> Yukarı devam analiz 48 saat (% 60 daha az hava nemi ile sınırlı) </td></tr></tbody&gt; </table> Tablo 1. Siklin B proteolizin analizi için kullanılan standart olarak ayarlar. Histon H2-GFP siklin B-SNAP floresans yoğunluğunu ölçülmesi için odak düzlem tanımlamak için bir yapı referans olarak kullanılmıştır. Birikimli fototoksisite önlemek için görüntü alma ayarlara göre odaklama işlemi sırasında düşük ışık yoğunluğu vardır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig1.jpg" /> Şekil 1. Endojen protein benzer çözünme özelliklerine sahip bir kimerik siklin B türevinin ifade yoluyla siklin B proteolizin ölçüm şematik. Darbe-kovalamaca etiketleme sonra floresan yoğunluğunda azalma APC / C-aktivitesinin bir ölçüsüdür. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4239/4239fig2.jpg" /> Şekil 2. 8 kuyu slaytlar veya 96 kuyucuğu üzerindeki hücrelerin analizi. Düzenli dağılımıiyi bir yüzey üzerinde hücreler 300 ul nihai hacim içinde yeniden süspansiyon elde edilir ve tek tek bir veya birkaç sıra el ile analiz için tanımlanan ise tavsiye edilir. Merkezi bölge içinde hücrelerin zenginleştirilmesi önceden doldurulmuş ya da hazneyi merkezine hücrelerin eklenmesi ile elde edilir. Bu tekniği farklı kuyularda otomatik görüntü elde etme durumunda tavsiye edilir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig3.jpg" /> Şekil 3,. Veri toplama sırası. Histon H2-GFP A) Algılama mitoz sırasında kromozom uyum odak düzlemi tanımı ve izlenmesi için kullanılır. B) TMR Yıldız floresans şiddetinin Floresan yoğunluğu siklin B-SNAP etiketli darbe takibin mutlak miktarı için bir ölçüdür. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4239/4239fig4.jpg" /> Şekil 4. Ortalama TMR Yıldız Temsilcisi Tarama ^ R Analiz yazılım tabanlı tasvirizamanla floresan yoğunlukları (alanına bölünmesiyle toplam TMRstar yoğunluğu). temsili bir hücre trace (mavi) seçimi. Ilgili görüntüleri (sağda gösterildiği gibi) eş zamanlı görselleştirme izin histon H2-GFP (yeşil) ve siklin B-SNAP (kırmızı). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239fig4large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/4239/4239fig5.jpg" /> Şekil 5. A + B) XY-nokta arsa üzerinde bir ilgi hücre temsil nokta yolluk örneği. C) zamanla ortalama TMRstar floresan yoğunluğu (alan tarafından ayrılan toplam TMRstar yoğunluğu) Görselleştirme nokta arsa kullanarak. D + E), Microsoft Excel&#39;de oluşturulmuş gibi NEBD (nükleer zarf dökümü) ve kromatin yoğunlaşması (mavi bar) arasında izomorf penceresi (diyagramda brigher alanı) siklin B-SNAP Temsilcisi floresans yoğunluk eğrisi. Anafaz t gösterilireğri üzerinde o mavi nokta. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239fig5large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . Film 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239movie1.avi" target="_blank">tamamlayıcı filmi görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol>
	<li>Musacchio, A., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle-assembly+checkpoint+in+space+and+time.">The spindle-assembly checkpoint in space and time.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).</li><li>Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregating+sister+genomes:+the+molecular+biology+of+chromosome+separation.">Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation.</a> Science. 297, 559-565 (2002).</li><li>Cahill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+mitotic+checkpoint+genes+in+human+cancers.">Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers.</a> Nature. 392, 300-303 (1998).</li><li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+instabilities+in+human+cancers.">Genetic instabilities in human cancers.</a> Nature. 396, 643-649 (1998).</li><li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics+and+the+cytoskeleton.">Cell mechanics and the cytoskeleton.</a> Nature. 463, 485-4892 (2010).</li><li>Schnerch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+APC/C+activity+in+the+presence+of+chromosomal+misalignment+in+unperturbed+cell+populations.">Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li><li>Keppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).</li><li>Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis.">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).</li><li>Malureanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+hypomorphic+mice+fail+to+counteract+de+novo+synthesis+of+cyclin+B1+in+mitosis.">Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis.</a> J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).</li><li>Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+spindle-assembly+checkpoint+response+requires+de+novo+transcription+and+translation+of+cyclin+B1.">Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Wolthuis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+and+Cks+direct+the+spindle+checkpoint-independent+destruction+of+cyclin.">Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin.</a> A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz burada siklin B proteoliz ve kromozom uyum eşzamanlı izleme kolaylaştıran bir canlı hücre görüntüleme tabanlı bir yaklaşım sunuyoruz. Bu yaklaşım mitotik kontrol çalışması tek hücre düzeyinde hücre popülasyonu soğukkanlı sağlar. Siklin B degradasyon eğrileri APC / C aktivitesini doğrudan içten kolaylaştırmak ve böylece dolaylı SAC 6 durumunu yansıtmaktadır. Bu yaklaşım, olsa Tarama ^ R yazılım dayalı kurulan, kolayca herhangi bir karşıl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Ürünün Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Reporter hücre hattı </td><td> üretilen in-house olarak 6 tarif </td><td> 11 muhabir hücreler klonu (U2Os bazlı siklin B-SNAP eksprese eden hücreler) </td><td></td></tr><tr><td> Retroviral siklin B-SNAP ifade vektörü </td><td> üretilen in-house olarak 6 tarif </td><td> pLNCX2-siklin B mut5-SNAP </td><td></td></tr><tr><td> Phenolred içermeyen DMEM </td><td> Gibco </td><td> 21063-029 </td><td> FCS, sodyum piruvat, penisilin / Streptococcus bil takviyesi gereklidir </td></tr><tr><td> SNAP-Cell TMR-Yıldız </td><td> New England Biolabs </td><td> S9105S </td><td> DMSO içinde Stok çözeltisi 400 uM </td></tr><tr><td> Özel Opstics Tabak iyi 96 </td><td> Costar </td&gt; <td> 3720 </td><td></td></tr><tr><td> μ-Slayt 8 kuyu, ibiTreat </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskopi ünitesi </td><td> Olimpos </td><td> İklim odası ile IX-81 ters mikroskop </td><td></td></tr><tr><td> Nesnel </td><td> Olimpos </td><td> UPLSAPO 20x objektif (NA 0.75) </td><td></td></tr><tr><td> Toplama yazılımı </td><td> Olimpos </td><td> Tarama ^ R Toplama yazılımı (v.2.2.09) </td><td></td></tr><tr><td> Analiz yazılımı </td><td> Olimpos </td><td> Tarama ^ R Analiz yazılımı (v.1.2.0.6) </td><td></td></tr></tbody></table>

studying proteolysis of cyclin b at the single cell level in whole cell populations

Hücre bölünmesi sırasında iki yavru hücre arasında kromozomların eşit dağılımı genetik değişmezlik 1 garanti için bir ön koşuldur. Kromozom ayrılması sırasında yanlışlıklar malignite bir işaretidir ve ilerleyici bir hastalık 2-4 ile ilişkilidir. Mili montaj noktası (SAC) her kromozom mitotik iğ 1. istikrarlı bir bipolar eki kurmuştur kadar geri metafaz hücrelere tutan bir mitoz gözetim mekanizmadır. SAC aktive müdahale ederek işlevini uygular APC / C securin ve siklin B proteoliz ve böylece kromozom ayırma ve mitotik çıkış engellemek için subunit Cdc20. Kromozomların yanlış eki SAC sinyalizasyon susturulmalarını engeller ve problemi kromozom missegregation, anöploidi ve malign büyümeleri 1 önlemek için çözülünceye kadar APC / C Cdc20 arasında devam inhibisyonu neden olur. I ele çalışmaların çoğuAPC / C-bağımlı proteoliz üzerine uygunsuz kromozomal eki nfluence mikrotübüle kromozomal eki ile etkileşime ilaçlar depolimerizasyon veya mikrotübül-dengeleyici kullanarak mili bozulması yararlandı. Mikrotübül kinetiği müdahale ulaşım ve kritik düzenleyiciler lokalizasyonu etkileyebileceğinden, bu prosedürler suni etkileri 5 inducing bir risk taşıyor. SAC mitoz sırasında APC / siklin B C-bağımlı proteoliz müdahale nasıl çalışma için hücre popülasyonlarının soğukkanlı, biz izin bir histon H2-GFP-tabanlı sistem kurulmuş metafaz mitotik kromozom uyumuna ve siklin B 6 proteolizin eşzamanlı izleme . Proteolitik profilleri tasvir etmek için, bir C-terminal parçası SNAP 6 (Şekil 1) ile bir kimerik siklin B raportör molekül üretilir. Kendi kendine etiketleme reaksiyonunda, SNAP-parçası ile kovalent bağ oluşturabilenalkylguanine taşıyıcılar (SNAP substrat) 7,8 (Şekil 1). SNAP yüzey molekülleri kolayca kullanılabilir ve değişik florokromlar geniş bir yelpaze taşırlar. Kimerik siklin B-SNAP molekülleri büyüme ortamı 7 (Şekil 1) zar-SNAP geçirgen alt tabakanın ilavesinden sonra etiketli hale gelir. Etiketleme reaksiyondan sonra, siklin B-SNAP floresans şiddetinin bir darbe-kovalamaca reaksiyon benzeri şekilde ve floresan yoğunlukları siklin B bozulması 6 (Şekil 1) düzeylerini yansıtacak düşer. Bizim sisteme paralel hücreleri (veya birkaç hücre popülasyonlarının) çok sayıda mitotik APC / C bağımlı proteolizin izlenmesini kolaylaştırır. Böylece, sistem aracıları / geçiş anafaz için metafaz de proteolitik aktiviteyi bozar edebiliyoruz küçük moleküller belirlemek için değerli bir araç olabilir. Ayrıca, mitoz sırasında siklin B sentezi gibi son zamanlarda önemli bir mechanis olarak öne sürülmüştürstabil siklin B ekspresyon düzeyleri 9,10 tutarak farelerde ve insanlarda bir mitoz blok teşvik m, bu sistem bize dengeli bir denge 6 bir unsuru olarak siklin B proteoliz analiz sağladı.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations at JoVE.com

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Geçiş anafaz-teşvik kompleksi (APC / C)-bağımlı ubikuitinasyon ve burada siklin B. sonraki yıkım, biz, darbe-kovalamaca etiketleme sonrasında, bir sistem kurulmuş tüm hücre popülasyonlarında siklin B proteoliz izleme sağlar ve tetiklenir anafaz için metafaz mitotik geçiş noktasından müdahale tespitini kolaylaştırır.

Tüm Cep Populasyonlarının Tek Hücre Düzeyinde Siklin B Proteoliz incelenmesi

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

studying-proteolysis-cyclin-b-at-single-cell-level-whole-cell

Research

JoVE Journal

Biology

10.4K Görüntüleme.  University Medical Center Freiburg. Geçiş anafaz-teşvik kompleksi (APC / C)-bağımlı ubikuitinasyon ve burada siklin B. sonraki yıkım, biz, darbe-kovalamaca etiketleme sonrasında, bir sistem kurulmuş tüm hücre popülasyonlarında siklin B proteoliz izleme sağlar ve tetiklenir anafaz için metafaz mitotik geçiş noktasından müdahale tespitini kolaylaştırır.

Video: Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

Işık tam hücreli Kayıtlar Retina Dilim Uyarıcı Synaptic Akımlar Uyarılmış

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Biyoloji

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression profiles of pyramidal neurons in layer III. It is well known that the cerebral cortex is an exceptionally heterogeneous structure comprising diverse regions, layers and cell types, each of which is characterized by distinct cellular and molecular compositions and therefore differential gene expression profiles. To circumvent the confounding effects of tissue heterogeneity, we used laser-capture microdissection (LCM) in order to isolate our specific cell-type i.e pyramidal neurons.
Approximately 500 pyramidal neurons stained with the Histogene staining solution were captured using the Arcturus XT LCM system. RNA was then isolated from captured cells and underwent two rounds of T7-based linear amplification using Arcturus/Molecular Devices kits. The Experion LabChip (Bio-Rad) gel and electropherogram indicated good quality a(m)RNA, with a transcript length extending past 600nt required for microarrays. The amount of mRNA obtained averaged 51&mu;g, with acceptable mean sample purity as indicated by the A260/280 ratio, of 2.5. Gene expression was profiled using the Human X3P GeneChip probe array from Affymetrix.

We describe a process using laser-capture microdissection to isolate and extract RNA from a homogeneous cell population, pyramidal neurons, in layer III of the superior temporal gyrus in postmortem human brains. We subsequently linearly amplify (T7-based) mRNA, and hybridize the sample to the Affymetrix human X3P microarray.

İnsan Postmortem Beyin Dokusu Tek Hücre Popülasyonlar Yüksek Kalite RNA Alınması

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

Tek Parçacık Düzeyinde Viral Fusion Kinetik Ölçüm yöntemi

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Tek ve Çok hücreli Bağlamlarda Invadopodia aracılı Ekstrasellüler Matriks Proteoliz Kantitatif Ölçümü

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentation is a periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic formation of blocks of tissue called somites along the body axis is evidence of a genetic oscillator patterning the developing embryo. In zebrafish, the intracellular clock driving segmentation is comprised of members of the Her/Hes transcription factor family organized into negative feedback loops. We have recently generated transgenic fluorescent reporter lines for the cyclic gene her1 that recapitulate the spatio-temporal pattern of oscillations in the presomitic mesoderm (PSM). Using these lines, we developed an in vitro culture system that allows real-time analysis of segmentation clock oscillations within single, isolated PSM cells. By removing PSM tissue from transgenic embryos and then dispersing cells from oscillating regions onto glass-bottom dishes, we generated cultures suitable for time-lapse imaging of fluorescence signal from individual clock cells. This approach provides an experimental and conceptual framework for direct manipulation of the segmentation clock with unprecedented single-cell resolution, allowing its cell-autonomous and tissue-level properties to be distinguished and dissected.

Somitogenesis is a rhythmic developmental process that spatially patterns the body axis of vertebrate embryos. Previously, we developed transgenic zebrafish lines that use fluorescent reporters to observe the cyclic genes that drive this process. Here, we culture dispersed cells from these lines and image their oscillations over time in vitro.

Tek Hücrelerde Zebra balığı Segmentasyon Clock Görüntüleme Dağınık Presomitic Mesoderm Hücre Kültürleri Üretimi

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

Tek Çekirdek Düzeyde HAT-1 Retrotransposition Analizi

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

KÜBİK Protokol Tüm Dağı Cilt Hazırlıkları Tek Hücre çözünürlükte Protein Anlatım Görseller

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.