Bu Transwell co-kültür yöntemi bağışıklık yanıtını bastırmak için tümör hücreleri tarafından kullanılan parakrin sinyal çalışması için kullanılır. Bu yöntem yeni salgılanan ligands keşfetmek için kullanılabilir, yanı sıra bağışıklık baskılayıcı etkileri mekanistik temelleri. Daha önce tümör salgılanan faktörlerin makrofaj pro-inflamatuar gen transkripsiyonuna nasıl engel olabileceğini göstermek için bu yöntemi kullandık.
Bu aletin tümör kaynaklı immün baskılama çalışmalarında geniş kapsamlı etkileri olduğuna inanıyoruz. Bu tekniğin en önemli avantajlarından biri, hücre-hücre temasının potansiyel olarak kafa karıştırıcı değişkeni olmadan tümör hücreleri ve bağışıklık hücreleri arasındaki parakrin sinyalizasyon çalışmaları için kullanılabilmedir. Bu platform aynı zamanda downstream analizi için moleküler biyolojik teknikler çeşitli münasip olduğunu.
Periton makrofajları hasat ettikten sonra, doğrudan 0,4 mikrometre polyester membran eklemek co-kültür altı-iyi plaka üst odaları içine plaka. Daha sonra üst oda bir mililitre ve alt oda 1.5 mililitre içeren kuyuya eklenmiş DMEM eklendi. %5 karbondioksitle 37 derecede üç gün kuluçkaya yat.
İlk olarak, atcc aşağıdaki kendi ortamda kültür ticari olarak kullanılabilir doku kültürü yöntemleri önerilir. Daha sonra, yapışık tümör hücrelerini pbs ile bir kez yıkayın. EDTA'da %0.05 tripsin ekleyin ve hücreler ayrışana kadar 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Ardından, FBS içeren ortamdaki hücreleri yeniden askıya alın. Pelet için beş dakika için 220 kez G hücre ve santrifüj toplam sayısını quantitate için bir hemositometre veya hücre sayacı kullanın. Santrifüj sırasında, geçirilmez membran destek plakaları içeren makrofajın üst ve alt odalarından ortayı aspire edin ve taze ortamla değiştirin.
Tümör hücrelerinin kaplandığı alt bölmeler için, hücre ilavesi için yeterli hacim bırakmak için 1,5 mililitre yerine bir mililitre orta ile doldurun. Santrifüj tamamlandığında, peletli tümör hücrelerinden orta aspire ve mililitre başına 300, 000 hücre konsantrasyonu ile eklenmiş DMEM hücreleri yeniden askıya. İstenilen kuyuların alt odasına bu hücre süspansiyon0,5 mililitre ekleyin.
Makrofaj pro-inflamatuar gen ekspresyonunu indüklemek için, mililitrede 100 nanogram ve mililitrede 50 nanogram konsantrasyonda LPS konsantrasyonuna interferon gama ekleyerek tek başına veya eş kültürlü makrofajları tedavi edin. Kültürde tedavi sürelerini gerektiği gibi değiştirin. Makrofaj aktivasyonu iki saat içinde gerçekleşir ve bazı tümör aracılı bastırma sekiz saat oluşur.
24 saat boyunca ortak kültür sağlam ve tutarlı tümör kaynaklı baskılama sağlar. Olumsuz bir kontrol olarak, kültür makrofajlar tek son ve tedavi edilmezse bırakın. Pozitif kontrol olarak, tek kültürlü makrofajları interferon gama ve LPS ile numuneler için kullanılan aynı konsantrasyonlarda tedavi edin.
İstenilen kuluçka süresi geçtikten sonra, test ihtiyaçlarına bağlı olarak hücre lisate veya durum kültürü ortamını istenildiği gibi izole edin. Kantitatif polimeraz zincir reaksiyon analizi için hücre lisatını izole etmek için, kuyunun her iki odasından ortayı aspire edin ve iki mililitre PBS ile bir kez yıkayın. RNA lysis tamponu makrofajları içeren üst hazneye uygulayın.
Bundan sonra, hücre lisatını serbest bırakmak için membranı hafifçe kazıyın ve RNA izolasyon kiti üreticisinin protokolüne göre daha fazla işleme için bir toplama tüpüne aktarın. Burada açıklanan ortak kültür yöntemi makrofajlar ve tümör hücrelerinin fiziksel temas olmadan kültürünü içerir. Tümör hücrelerinin yokluğunda kültürlenmiş peritoneal makrofajlar negatif ve pozitif kontroller olarak kullanılır.
Peritoneal makrofajlar B16F10 tümör hücrelerinin varlığında eş kültürlü ancak uyarıcı aktive olmadan pro-inflamatuar ilişkili genlerin ekspresyonunu artırmaz. Bu tümör salgılanan ligands ya kendileri tarafından pro-inflamatuar gen ekspresyonu neden yeterli olmadığını ima, ya da tümör salgıları ile bağışıklık aktivasyonu varsa, parakrin ligands doğal seviyelerine bastırmak için yeterli dir. Bu eş-kültür yöntemi, interferon gama ve LPS ile polarize makrofajlar tümör hücrelerinin varlığında kültürlendiğinde, inflamasyona bağlı gen ekspresyonunun baskılanmasının %60'a kadar azaldığı, rurine makrofaj hücre hattı J774 peritonmakrofajlarının yerine geçildiğinde makrofaj pro-inflamatuar gen baskılanmasının karşılaştırılabilir düzeyde gözlendiğini göstermektedir.
Önceki çalışmada makrofaj aktivasyonunu inhibe edebilir bir tümör salgılanan faktör olarak protein S tespit etmiştir, bu nedenle geçirgen membran destek co-kültür modeli 24 saat sonra şartlı ortamda protein S konsantrasyonu teşif etmek için bir lysA ile birlikte kullanılır. İnterferon gama ve LPS ile tedavi edilen B16F10 melanom hücrelerinden klimalı ortamda, Protein S mililitre başına yaklaşık 475 nanogram konsantrasyonu ile ifade edilir. Aynı koşullarda tedavi edilen peritoneal makrofajlar mililitrede yaklaşık 61 nanogram protein S'yi ifade etti.
İlginçtir, co-kültür, interferon gama protein S konsantrasyonu ve LPS tedavi iyi mililitre başına yaklaşık 86 nanogram oldu. Bu da ya makrofajların tümörse salgılanan protein S'i yuttuğunda ya da Makrofajlar varlığında B16F10 hücreleri tarafından salgılanan Protein S miktarının önemli ölçüde azaldığını göstermektedir. Bu sonuçlar, makrofajlar tümör hücreleri ile birlikte kültürlendiğinde makrofaj aktivasyonu ve parakrin sinyalizasyon derin değişiklikler vurgulamak.
Transwell ortak kültür yöntemi parakrin sinyalizasyon ile ilgili çeşitli soruları yanıtlayabilir. Tümör salgılanan proteinlerin makrofajlarda çeşitli sinyal yollarını nasıl değiştirdiğini belirlemek için Batı leke analizi yapılabilir.
