이러한 트랜스웰 공동 배양 방법은 종양 세포가 면역 반응을 억제하는 데 사용되는 파라크리인 신호를 연구하는 데 사용된다. 이 방법은 새로운 분비 리간드뿐만 아니라 면역 억제 효과의 기계론적 기초를 발견하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 이전에 종양 분비 요인이 대식세포 프로 염증 유전자 전사를 약화시킬 수있는 방법을 보여주기 위해이 방법을 사용했다.
우리는 이 공구가 종양 유래 면역 억제의 연구 결과에 있는 광범위한 연루가 있다고 믿습니다. 이 기술의 주요 장점 중 하나는 세포 대 세포 접촉의 잠재적으로 혼동 변수없이 종양 세포와 면역 세포 사이의 파라크리인 신호를 연구하는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 이 플랫폼은 또한 다운스트림 분석을 위한 다양한 분자 생물학적 기술에 적합합니다.
수막 대식대를 수확 한 후 0.4 마이크로 미터 폴리 에스테르 멤브레인의 상부 챔버로 직접 판화하여 공동 배양 6 웰 플레이트를 삽입하십시오. 그런 다음 상부 챔버에 1 밀리리터를 포함하고 하단 챔버는 1.5 밀리리터를 포함하도록 우물에 보충 DMEM을 추가했습니다. 이산화탄소 5%를 37도에서 3일간 배양합니다.
첫째, ATCC 권장 조직 배양 방법에 따라 각각의 배지에서 상용화 가능한 종양 세포를 배양한다. 다음으로, PBS로 부착된 종양 세포를 한 번 씻는다. EDTA에 0.05%의 트립신을 추가하고 세포가 분리될 때까지 섭씨 37도에서 배양합니다.
그런 다음 FBS를 포함하는 매체에서 세포를 다시 일시 중단합니다. 혈혈계 또는 세포 카운터를 사용하여 총 세포 수와 원심분리기를 5분 동안 220배 G에서 양수화한다. 원심분리 하는 동안, 투과성 멤브레인 지지판을 포함하는 대식대식의 상부 및 하부 챔버에서 배지를 흡인하 고 신선한 매체로 대체 한다.
종양 세포가 도금될 하부 챔버의 경우, 세포 첨가를 위한 충분한 부피를 남기기 위해 1.5 밀리리터 대신 배지 1밀리리터로 채우십시오. 원심분리가 완료되면, 펠릿 종양 세포로부터 배지를 흡인시키고 밀리리터당 300, 000세포의 농도로 보충DMEM에서 세포를 다시 중단한다. 원하는 우물의 하부 챔버에 이 세포 현탁액의 0.5 밀리리터를 추가합니다.
대식세포 프로 염증 성 유전자 발현을 유도하기 위해 밀리리터 당 100 나노 그램의 농도에 인터페론 감마를 첨가하여 밀리리터 당 50 나노 그램의 농도로 심백성 또는 공동 배양 대식세포를 치료하십시오. 필요에 따라 문화에서 치료 시간의 기간을 변경합니다. 대식세포 활성화는 2시간 이내에 발생하며, 일부 종양 매개 억제는 8시간 이내에 발생합니다.
24시간 동안의 공동 배양은 견고하고 일관된 종양 유래 억제를 낳습니다. 부정적인 제어로, 문화 대식세포는 노래하고 치료되지 않은 둡니다. 양수 조절으로, 시료에 사용되는 것과 동일한 농도에서 인터페론 감마 및 LPS로 노래배양 된 대식세포를 치료하십시오.
원하는 잠복기 시간이 경과한 후, 테스트 요구에 따라 원하는 대로 세포 리세테 또는 조건 배양 배지를 분리한다. 정량적 중합효소 연쇄 반응 분석을 위해 세포 용액을 분리하고, 우물의 양 챔버에서 배지를 흡인하고 PBS의 2밀리리터로 한 번 세척한다. 대식세포가 함유된 상부 챔버에 RNA 리시스 버퍼를 적용합니다.
그 후, 세포를 용액을 방출하고 RNA 격리 키트 제조업체의 프로토콜에 따라 추가 처리를 위해 수집 튜브로 전송하기 위해 멤브레인을 부드럽게 긁어낸다. 여기에서 기술된 공동 배양 방법은 물리적 접촉 없이 대식세포 및 종양 세포의 배양을 포함한다. 종양 세포의 부재에서 배양 된 회대식은 음수 및 양성 대조군으로 사용된다.
B16F10 종양 세포의 존재에서 공동 배양되는 회대대세포는 자극을 활성화하지 않고 는 프로 염증 관련 유전자의 발현을 증가시키지 않는다. 이것은 종양 분비리 리간드가 스스로 프로 염증 성 유전자 발현을 유도하기에 충분하지 않거나 종양 분비에 의한 면역 활성화가있는 경우 파라크리네 리간드가 네이티브 수준으로 억제하기에 충분하다는 것을 의미합니다. 이러한 공동 배양 방법은 인터페론 감마 및 LPS에 의해 편광되는 대식세포가 종양 세포의 존재에서 배양될 때, 염증 관련 유전자 발현의 억제가 60%만큼 감소되었다는 것을 보여 주며, 뮤린 대식세포 세포주 J774가 코테톤 대식세포세포간을 대체할 때 유사한 수준의 대식세포증유전자 억제가 관찰된다.
이전 연구는 단백질 S를 대식세포 활성화를 억제할 수 있는 종양 분비인자로 확인하였기 때문에 투과성 멤브레인 지원 공동 배양 모델은 lysA와 함께 24시간 후 조건부 배지에서 단백질 S의 농도를 분석하는 데 사용된다. 인터페론 감마 및 LPS 처리B16F10 흑색종 세포로부터 의 조건된 매체에서, 단백질 S는 밀리리터 당 대략 475 나노그램의 농도로 표현됩니다. 동일한 조건에서 치료된 회대대식은 밀리리터당 약 61 나노그램에서 단백질 S를 표현하였다.
흥미롭게도, 공동 배양시, 인터페론 감마 및 LPS 처리 우물에서 단백질 S의 농도는 밀리리터 당 약 86 나노그램이었다. 이는 대식세포가 종양 분비 단백질 S를 섭취하거나 B16F10 세포에 의해 분비되는 단백질 S의 양이 대식세포의 존재시 실질적으로 감소한다는 것을 시사한다. 이러한 결과는 대식세포가 종양 세포와 공동 배양될 때 대식세포 활성화 및 파라크리안 신호의 심오한 변화를 강조한다.
Transwell 공동 문화 방법은 파라크리인 신호와 관련된 다양한 질문에 대답할 수 있습니다. 서양 얼룩 분석은 종양 분비 단백질이 대식세포에 있는 각종 신호 통로를 변경하는 방법을 결정하기 위하여 실행될 수 있었습니다.
