שיטה זו Transwell שיתוף תרבות משמש לחקר איתות פרצרין בשימוש על ידי תאים סרטניים כדי לדכא את התגובה החיסונית. שיטה זו יכולה לשמש לגילוי ליגנדים מופרשים חדשניים, כמו גם את ביסודות המקניסטיים של ההשפעות המדכאות שלהם. השתמשנו בעבר בשיטה זו כדי להראות כיצד גורמים המופרשים על ידי גידולים יכולים לעמעם את שעתוק הגנים התומכים במאקרופאג'.
אנו מאמינים שלאיל זה יש השלכות נרחבות בחקר דיכוי חיסוני שמקורו בגידולים. אחד היתרונות העיקריים של טכניקה זו היא שניתן להשתמש בה כדי ללמוד איתות פרצרין בין תאים סרטניים לתאי החיסון ללא המשתנה המבלבל של מגע בין תא לתא. פלטפורמה זו נוחה גם למגוון טכניקות ביולוגיות מולקולריות לניתוח במורד הזרם.
לאחר קצירת מקרופאגים צפי, צלחת אותם ישירות לתוך התאים העליונים של קרום פוליאסטר מיקרומטר 0.4 מיקרומטר להוסיף שיתוף תרבות שישה באר צלחת. לאחר מכן הוסיף DMEM בתוספת לגם כך התא העליון מכיל מיליליטר אחד ואת התא התחתון מכיל 1.5 מיליליטר. דגירה במשך שלושה ימים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
ראשית, תאים סרטניים זמינים מסחרית במדיום שלהם, בעקבות ATCC מומלץ שיטות תרבות רקמות. לאחר מכן, לשטוף את התאים הגידול חסיד פעם אחת עם PBS. הוסיפו 0.05% טריפסין ב-EDTA ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס עד שהתאים מתנתקים.
לאחר מכן השהה מחדש את התאים במדיה המכילה FBS. השתמש hemocytometer או מונה התא לכמת את המספר הכולל של תאים צנטריפוגה ב 220 פעמים G במשך חמש דקות כדי גלולה. במהלך הצנטריפוגה, שאף את המדיום מהתאיים העליונים והתחתונים של המקרופאג' המכילים לוחות תמיכה בממברנה חדירים והחלף במדיום טרי.
עבור התאים התחתונים שבהם תאים סרטניים יהיו מצופים, למלא עם מיליליטר אחד של בינוני במקום 1.5 מיליליטר להשאיר נפח מספיק לתוספת תאים. כאשר הצנטריפוגה הושלמה, שאפו את המדיום מהתאים הגידוליים המוגלתיים והשעו מחדש את התאים ב- DMEM בתוספת ריכוז של 300, 000 תאים למיליליטר. הוסף 0.5 מיליליטר של השעיית תא זה לתא התחתון של הבארות הרצויות.
כדי לגרום לביטוי גנים פרו דלקתיים מקרופאגים, לטפל מקרופאגים יחיד או במשותף על ידי הוספת גמא אינטרפרון בריכוז של 100 ננוגרם למיליליטר ו LPS בריכוז של 50 ננוגרם למיליליטר. לשנות את משך זמני הטיפול בתרבות לפי הצורך. הפעלת מקרופאג' מתרחשת תוך שעתיים, ודיכוי מסוים מתווך בגידולים מתרחש בשמונה שעות.
תרבות שותף במשך 24 שעות מניבה דיכוי חזק ועקבי שמקורו בגידולים. כשליטה שלילית, מקרופאגים תרבותיים בנפרד ומשאירים ללא טיפול. כשליטה חיובית, התייחסו למאקרופאגים בעלי תרבות יחידה עם אינטרפרון גמא ו-LPS באותם ריכוזים המשמשים לדגימות.
לאחר שחלף זמן הדגירה הרצוי, יש לבודד את התא או למצב את מדיום תרבות בהתאם לרצוי בהתאם לצרכי הבדיקה. כדי לבודד את ליסנט התא לניתוח תגובת שרשרת פולימראז כמותית, שאפו את המדיום משני תאי הבאר ושטפו פעם אחת עם שני מיליליטר של PBS. החל מאגר תות RNA על התא העליון המכיל את המקרופאגים.
לאחר מכן, בעדינות לגרד את הממברנה כדי לשחרר את התא lysate ולהעביר אותו צינור איסוף לעיבוד נוסף על פי הפרוטוקול של יצרן ערכת בידוד RNA. שיטת השיתוף המתוארת כאן כוללת תרבות של מקרופאגים ותאי גידול ללא מגע פיזי. מקרופאגים צפי מתורבתים בהיעדר תאים סרטניים משמשים בקרות שליליות וחיוביות.
מקרופאגים פריטון במשותף מתורבתים בנוכחות תאים סרטניים B16F10 אבל בלי להפעיל גירויים אינם מגבירים את הביטוי של גנים הקשורים פרו דלקתיות. משמעות הדבר היא כי ליגנדים המופרשים על ידי הגידול אינם מספיקים כדי לגרום לביטוי גנים פרו דלקתיים בעצמם, או אם יש הפעלה חיסונית על ידי הפרשות גידול, ליגנדים פרצרין מספיקים כדי לדכא אותו לרמות המקומיות שלה. שיטת שיתוף זו ממחישה כי כאשר מקרופאגים מקוטבים על ידי אינטרפרון גמא ו- LPS מתורבתים בנוכחות תאים סרטניים, דיכוי ביטוי גנים הקשורים לדלקת הופחת בשיעור של עד 60%A רמה דומה של דיכוי גנים מקרופאגים פרו דלקתיים נצפתה כאשר קו תא המקרופג' המורין J774 מוחלף במקרופאגים הצפקים.
עבודה קודמת זיהתה חלבון S כגורם מופרש בגידול שיכול לעכב הפעלת מקרופאג', כך מודל התמיכה בממברנה חדירה שיתוף תרבות משמש בשילוב עם lysA כדי להתוות את הריכוז של חלבון S במדיה מותנה לאחר 24 שעות. במדיה מותנה של אינטרפרון גמא ו LPS שטופלו B16F10 מלנומה תאים, חלבון S מתבטא בריכוז של כ 475 ננוגרם למיליליטר. מקרופאגים צפי שטופלו באותם תנאים הביעו חלבון S בכ 61 ננוגרם למיליליטר.
מעניין, כאשר מתורבתים במשותף, הריכוז של חלבון S בגמא אינטרפרון ואת LPS מטופלים היטב היה כ 86 ננוגרם למיליליטר. הדבר מצביע על כך שמאקרופאגים בולעים חלבון S המופרש בגידולים או שכמות החלבון S המופרשת על ידי תאי B16F10 יורדת באופן משמעותי כאשר הם נמצאים בנוכחות מקרופאגים. תוצאות אלה מדגישות שינויים עמוקים של הפעלת מקרופג ואיתות פרצרין כאשר מקרופאגים מתורבתים במשותף עם תאים סרטניים.
שיטת השיתוף של טרנסוול יכולה לענות על מגוון שאלות הנוגעות לאיתות פרצרין. ניתוח כתם מערבי יכול להתבצע כדי לקבוע כיצד חלבונים המופרשים על ידי הגידול משנים מסלולי איתות שונים במקרופאגים.
