Этот метод совместной культуры Transwell используется для изучения паракринной сигнализации, используемой опухолевыми клетками для подавления иммунного ответа. Этот метод может быть использован для обнаружения новых секретных лигандов, а также механистических основ их иммунного подавления эффектов. Ранее мы использовали этот метод, чтобы показать, как опухолевые факторы могут ослабить макрофаг провоспалительные транскрипции генов.
Мы считаем, что этот инструмент имеет широкие последствия в изучении опухолевых иммунного подавления. Одним из основных преимуществ этого метода является то, что он может быть использован для изучения паракринной сигнализации между опухолевыми клетками и иммунными клетками без потенциально запутанной переменной контакта между клетками. Эта платформа также подменяется к различным молекулярно-биологическим методам для анализа ниже по течению.
После сбора перитонеальных макрофагов, пластины их непосредственно в верхние камеры 0,4 микрометра полиэфирной мембраны вставить совместно культуры шесть хорошо пластины. Затем добавили дополненный DMEM к хорошо так, что верхняя камера содержит один миллилитр и нижняя камера содержит 1,5 миллилитров. Инкубировать в течение трех дней при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом.
Во-первых, культура коммерчески доступны опухолевых клеток в их соответствующей среде, после ATCC рекомендовал методы культуры тканей. Далее, мыть адепт опухолевых клеток один раз с PBS. Добавьте 0,05%трипсина в ЭДТА и инкубировать при 37 градусах по Цельсию, пока клетки не отсоединятся.
Затем повторно приостанавливать ячейки в средствах массовой информации, содержащих FBS. Используйте гемоцитометр или клеточный счетчик для количественной оценки общего количества клеток и центрифуг в 220 раз G в течение пяти минут, чтобы гранулировать. Во время центрифугации аспирировать среду из верхней и нижней камер макрофага, содержащего проницаемые мембранные вспомогательные пластины, и заменить свежей средой.
Для нижних камер, где опухолевые клетки будут поцаряться, заполните одним миллилитром среды вместо 1,5 миллилитров, чтобы оставить достаточный объем для добавления клеток. Когда центрифугация завершена, аспирировать среды из гранулированных опухолевых клеток и вновь приостановить клетки в дополненных DMEM в концентрации 300000 клеток на миллилитр. Добавьте 0,5 миллилитров этой клеточной подвески в нижнюю камеру нужных скважин.
Чтобы вызвать макрофаг провоспалительные экспрессии генов, лечить потихоньку или совместно культурных макрофагов, добавив интерферон гамма в концентрации 100 нанограмм на миллилитр и LPS в концентрации 50 нанограмм на миллилитр. Варьировать продолжительность времени лечения в культуре по мере необходимости. Активация макрофагов происходит в течение двух часов, и некоторые опухоли опосредованное подавление происходит на восемь часов.
Со-культура в течение 24 часов дает надежное и последовательное подавление опухоли. В качестве отрицательного контроля, культура макрофаги по-настоящему и оставить без лечения. В качестве положительного контроля, лечить отдельно-культурных макрофагов с интерферон гамма и LPS в тех же концентрациях, используемых для образцов.
После желаемого инкубации время прошло, изолировать лизолировать клетки или состояние культуры среды по желанию в зависимости от потребностей тестирования. Чтобы изолировать лизат клетки для количественного анализа цепной реакции полимеразы, аспирировать среду из обеих камер хорошо и мыть один раз с двумя миллилитров PBS. Нанесите буфер РНК-лиза на верхнюю камеру, содержащую макрофаги.
После этого аккуратно соскреблите мембрану, чтобы освободить лисат клетки и перенесите ее в трубку для дальнейшей обработки в соответствии с протоколом производителя изоляционных комплектов РНК. Описанный здесь метод совместной культуры включает в себя культуру макрофагов и опухолевых клеток без физического контакта. Перитонеальные макрофаги, культурные при отсутствии опухолевых клеток, используются в качестве отрицательного и положительного контроля.
Перитонеальные макрофаги совместно культурируются в присутствии опухолевых клеток B16F10, но без активации стимулов не увеличивают экспрессию провоспалительных связанных генов. Это означает, что опухолевых лигандов либо недостаточно, чтобы вызвать провоспалительные экспрессии генов сами по себе, или если есть иммунная активация выделения опухоли, паракрин лиганды достаточно, чтобы подавить его до своего родного уровня. Этот метод совместной культуры иллюстрирует, что, когда макрофаги поляризованы интерферонной гаммой и LPS культурируются в присутствии опухолевых клеток, подавление воспаления связанных экспрессии генов было сокращено на столько, сколько 60%Сопоставимый уровень макрофага провоспалительные подавления генов наблюдается, когда мурин макрофаг клеточной линии J774 заменяется брюшной макрофаги.
Предыдущая работа определила протеин S как тумор-секретный фактор который может ингибировать активацию макрофага, поэтому проницаемая модель поддержки мембраны co-культуры использована в сочетании с lysA для того чтобы assay концентрация протеина S в условных средствах после 24 часов. В условных средствах массовой информации из интерферон гамма и LPS-обработанных B16F10 клеток меланомы, белок S выражается в концентрации около 475 нанограмм на миллилитр. Перитонеальные макрофаги, обработанные в тех же условиях, выражали белок S примерно на 61 нанограмм на миллилитр.
Интересно, что при совместной культуре концентрация белка S в гамма-интерфероне и хорошо обработанной LPS составила примерно 86 нанограмм на миллилитр. Это говорит о том, что либо макрофаги, высекаемые опухолью белка S, либо о том, что количество белка S, выделяется клетками B16F10, существенно снижается при наличии макрофагов. Эти результаты подчеркивают глубокие изменения активации макрофага и сигнализации паракрина, когда макрофаги совместно культуры с опухолевыми клетками.
Метод совместной культуры Transwell может ответить на различные вопросы, относящиеся к сигнализации паракрина. Западный анализ помарки можно было бы провести, чтобы определить, как опухолевые белки изменяют различные сигнальные пути в макрофагах.
