Bu protokol, insan uygulamaları için kolayca değiştirilebilen potansiyel olarak yeni bir tedavi stratejisini açıklamaktadır. Bu teknik doğrudan periferik lenfoid dokularda bağırsak-homing düzenleyici T hücrelerinin indüksiyon artırır ve stably son derece pro-inflamatuar ortamlarda bile uygulanabilir. Bu teknikler aynı zamanda periferik bağışıklık sistemi içinde aktif D vitamini ve A vitamini rolünü araştırmak için kullanılabilir.
Bu görsel gösteri, bu tekniğin başarısı için kritik olan yüksek kaliteli mühendislik dendritik hücrelerin üretimi için adım adım talimatlar sağlayacaktır. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit 24 saat kuluçka için 150 cm-10-D hücre kültürü orta 20 mililitre yedi 293T hücreleri bir kez 10 tohumlama ile başlayın. Ertesi gün, taze hazırlanmış iki kat konsantre HBS çözeltisi 1.62 mililitre ekleyin, zarf plazmid 9.5 mikrogram, ambalaj plazmid 17.5 mikrogram, ve 50 mililitrelik konik tüp LENTI-CYP-ALDH plazmid 27 mikrogram.
Tüp içeriğinin son hacmini 3,0375 mililitreye kadar su ile getirin ve ardından iki azı dişi kalsiyum klorür 202,5 mikrolitre ilave edin. 293T kültürüne 3,24 mililitre çözelti eklemeden önce, kabı hafifçe döndürerek 20 dakika oda sıcaklığında DNA çökeltme karışımını bırakın. Plakaları, her bir tabağı PBS ile hafifçe yıkamadan ve hücreleri CM-4-D kültür ortamıyla beslemeden önce 24 saat boyunca kuvöze yerleştirin.
Kültürün başka bir 24 saat sonra, dört ila sekiz santigrat depolama için steril şişeler içine supernatants hasat ve başka bir 24 saat boyunca taze CM-4-D orta hücreleri beslemek. Dördüncü günde, supernatants tekrar hasat ve 0.45 mikrometre filtre hem gün üç ve dört supernatants zorlanma. Daha sonra, 24 saat boyunca santrifüj ile VSV-G psödotipli virüs konsantre.
Ertesi gün süpernatants decant. Tüpler birkaç dakika için steril bir biyo-güvenlik kabininde bir kağıt havlu üzerinde drenaj izin, sonra kültür çanak başına% 5 gliserol içeren steril PBS 33.3 mikrolitre pelet resuspend. Kemik iliği dendritik hücre üretimi için, BALB/c farelerinden hasat edilen tibias ve femurları taze kültür ortamı nı içeren 100 ila 20 milimetrelik bir kültür yemeğine yerleştirin.
Kemiklerden herhangi bir doku kaldırmak için kesme makas ve forceps kullanın. Tüm kemikler temizlendikten sonra, kemik iliği boşluklarını ortaya çıkarmak için her kemiğin iki ucunu kesmek için makas kullanın. Her kemiği 10 mililitrelik taze kültür ortamıyla yıkamak için 30 gauge iğneyle donatılmış 10 mililitrelik bir şırınga kullanın ve kemik iliğini 15 mililitrelik bir tüpte toplayın.
Tüm kemik iliği toplandığında, merkezle kemik iliğini tortulayın ve iki mililitre kırmızı kan hücresi lisis tamponu içinde peleti yeniden askıya alın. Ara sıra sallayarak oda sıcaklığında dört ila beş dakika sonra, hücre kültürü orta 10 mililitre ile reaksiyonu durdurmak ve santrifüj ile hücreleri toplamak. Cm-10-R kültür orta 10 mililitre pelet resuspend sayma ve cm-10-R kültür orta konsantrasyon mililitre başına altı hücre için bir kez 10 hücreleri ayarlamak.
Daha sonra, hücrelere rekombinant murine GM-CSF mililitre başına 100 birim ve IL-4 mililitre başına 10 birim ekleyin. 48 saat boyunca 37 santigrat derece ve % 5 karbondioksit onların kuluçka için altı kuyu kültür plaka bireysel kuyular içine hücrelerin plaka dört mililitre. Kuluçka sonunda, yavaşça non-yapışık hücreleri aspire.
Bir ek 48 saat için hücre kültürü kuluçka hücreleri iade etmeden önce kültürlere GM-CSF ve IL-4 ile takviye taze orta ekleyin. İkinci kuluçka sonunda, non-yapışık kemik iliği onların santrifüj için 50 mililitre konik tüp içine dendritik hücreler elde hasat. BMDC-CYP-ALDH hücreleri oluşturmak için, iyi konsantrasyon başına CM-10-R orta 500 mikrolitre başına altıncı dendritik hücreler için bir kez on kültürleri yeniden askıya, ve plaka 500 hücre mikrolitre yeni bir altı iyi kültür plaka her kuyuiçine.
Her kuyuya 50 mikrolitre LENTI-CYP-ALDH virüsü ve mililitre başına 8 mikrogram protamin ekleyin, sonra plakayı 24 saat boyunca kuvöze yerleştirin. Ertesi gün, supernatants taze kültür ortamı ile değiştirin ve başka bir 24 saat için hücre kültürü kuluçka için plakaları iade. İkinci kuluçka sonunda, hücreler fonksiyonel analizler için hasat tan önce 24 saat boyunca kuyu başına mililitre başına 100 nanogram ile aktive edilebilir.
Ebeveyn kemik iliği türetilen dendritik hücreler ile karşılaştırıldığında, BMDC-CYP-ALDH hücreleri 1-alfa-hidroksilaz gelişmiş bir ifade görüntüler. BMDC-CYP ve BMDC-CYP-ALDH hücrelerinin kültür supernatants D vitamini aktif form konsantrasyonları yaklaşık 20 kat daha yüksek bu ebeveyn kemik iliği kaynaklı dendritik hücre ve BMDC-ALDH hücre kültürleri gözlenen daha yüksektir. SUBstrat ile tedavi edilen BMDC-CYP-ALDH hücrelerinin ortalama floresan yoğunlukları, substrat ile tedavi edilen ebeveyn kemik iliği türetilen dendritik hücrelere göre yaklaşık altı kat daha fazladır.
Bu, BMDC-CYP-ALDH hücrelerinin retinal dehydehidrogenaz-2 enzimatik aktivitesini önemli ölçüde ifade ettiğini göstermektedir. 25-hidroksi D vitamini ve retinal ile tedavi EDILEN DC2.4 hücreleri foxp3 pozitif CCR9 pozitif CD4 pozitif T hücrelerinin bolluğunda önemli bir değişikliğe neden olmaz. Buna karşılık, DC2.4 CYP-ALDH hücreleri 25-hidroksi D vitamini ve retinal ile tedavi konsantrasyonbağımlı bir şekilde bağırsak-homing düzenleyici T hücrelerinin önemli ölçüde daha yüksek sayıda indükler.
Ayrıca, intraperitoneally enjekte kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında, DC CYP-ALDH hücreleri de BALB / c alıcı hayvanlara intraperitoneal enjeksiyon sonra foxp3 pozitif CCR9 pozitif CD4 pozitif T hücrelerinin sayısında önemli bir artış neden. İşlemin başarısı sağlıklı T hücrelerinin hazırlanmasına ve doğru hazırlanmış DNA karışımına bağlıdır.
