Bu protokol, DMD alanında güvenilir sonuçlar elde etmek için önemli olan klinik öncesi ortamlarda ve klinik çalışmalarda kas dokusunun hazırlanması ve işlenmesi için standart laştırılmış bir metodoloji sunmaktadır. Teknikler DMD için ekson atlama denemeleri için ilgilidir. Ve ana avantajı, onlar iyi kurulmuş ve topluca yürütülür eğer tekrarlanabilir olmasıdır.
Bu teknikler esas olarak DMD ekson atlama üzerinde duruldu, ancak astar değişikliği ile, aynı teknikler splicing tedavileri ile tedavi diğer hastalıklariçin uygulanabilir. Bu yöntemler hem rna hem de protein atlama verimliliğini sağlamak için kullanılabilir. Analiz için bir örnek hazırlamak için, ilk sakız yumuşak ve yapışkan hale gelene kadar tragacanth sakız ve su eşit hacimlerde karıştırın.
Bu karışımı 25 mililitrelik şırıngalara yükleyin ve 0,5 ila bir santimetre lik sakızı tek tek mantar disklerine dağıtın. Diskleri karşı tarafa etiketleyin ve sıvının bir kısmı donana kadar sıvı nitrojene bir kap isopentane yerleştirin. Mantara dik her kasın uzunlamasına ekseni ile diskler üzerinde tragacanth sakız içine her örnek yerleştirin.
Yerde kas tutmaya yardımcı olmak için her kas ın altına sakız yerleştirin ve soğuk isopentane örnekleri dondurmak için cımbız kullanın. Numuneleri geçici olarak kuru buza yerleştirmeden önce bir dakika veya tamamen donana kadar sürekli olarak hareket ettirin. Daha sonra, 80 santigrat depolama için cam şişeler içinde örnekleri yerleştirin.
Analiz için dondurulmuş kas dokusu bölüm için, 25 santigrat derece bir çalışma sıcaklığına bir kriyostat ayarlayın, ve tutucu üzerine kas bloğu monte etmek. Düz bölümler elde edilene kadar doku bloğunu kırpın. Ters transkripsiyon PCR ve Batı leke analizi için 10 mikrometre kalınlığında dilimler elde edin.
İmmünohistokimyasal analiz için, altı ila sekiz mikrometre kalınlığında dilimler elde etmek ve hematoksilin ve eozin boyama için, 10 ila 12 mikrometre kalınlığında dilimler elde. Onların edinimi sonra, iki mililitre tüpler dilimlenmiş bölümleri yerleştirin. PCR ve batı lekeleme için örnekleri 80 santigrat derecede saklayın.
Burada mikroçip elektroforez sistemi, ters transkriptaz PCR reaksiyonlarının jel görüntüleri ve bir doz yükseltme fazı bir çalışmada antisense oligonükleotid ile tedavi öncesi ve sonrası iki hastadan atlanan bandın sekanssonuçları gösterilmiştir. Her iki hastada da silme ler var. Beklendiği gibi, tedaviden önce, her iki hastada da atlama yoktu ve sadece atlanamayan bir bant görüntülenemedi.
Tedavinin 12 hafta sonra, net bir atlanan alt bant ikinci hasta için görselleştirilmiş, ancak, hala ilk hasta için herhangi bir atlanan ürün tespit etmek zordu. Sıralama sonuçları ikinci hasta için 47 ve 54 ekstremite, ilk hasta için ise 44 ve 54 ekstremite ler gösterdi. Atlanan yüzdeyi hesaplamak için, atlanan bandın molar konsantrasyonu atlanan ve atlanmamış bantlara bölündü.
Beklendiği gibi, tedavi öncesi Western blot tarafından distrofin bandı saptanmadı. Tedaviden sonra, sağlıklı kontrolde gözlenene göre daha düşük molekül ağırlığına sahip ikinci hastadan bir bant saptandı. Ancak ilk hastada tedavi den sonra tespit edilebilir distrofin düzeyleri saptanmadı.
Bu doğru kas dokusu işlemek için önemlidir, ve tutarlı bir şekilde tragacanth sakız üzerinde her örnek yerleştirmek için. Doku bölümleri pcr yapay, dijital PCR, Batı leke, immünohistokimya ve omik farklı türleri de dahil olmak üzere farklı şekillerde bir dizi analiz edilebilir. Bu teknikler, farklı eksyonları hedefleyen ilaçların geliştirilmesi, geliştirilmesi, ek ekson atlama ve viral tabanlı ve dmd için düzenleme tekrar geliştirilmesi için uygulanabilir hızlandırılabilir.
