Biz yazının hazırlanması ile yaptığı destek ve yardım için Dr. Roger Erickson teşekkür ederim. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenen (Hibe Numarası RO1CA177984, RO1CA138642), prostat kanseri (BX001604) VA programı projesi.

Formalin ile sabitlenmiş, parafine gömülmüş (FFPE) ya da dondurulmuş, prostat kanseri örnekleri SFVAMC elde edildi. Numuneler SFVAMC radikal prostatektomi uygulanan prostat kanserli hastaların idi. Yazılı bilgilendirilmiş onam tüm hastalar alındı ​​ve çalışma İnsan Araştırmaları UCSF Komitesi tarafından onaylandı. Seçenek olarak ise, prostat kanseri doku mikrodizileri, ticari kaynaklardan temin edilerek MiRNA ISH ile analizler için kullanılmıştır. Analiz prostat kanseri hastaları için Klinikopatolojik ve takip bilgileri toplanmıştır. 1. Doku numuneleri <ol><li> H &amp; E, üreticinin protokolü aşağıdaki bir mikrotom ve leke kullanılarak 10 um bölüme prostat kanseri dokusu örnekleri kesin. </li><li> Prostat kanseri odaklarının belirlenmesi için lekeli slaytlar yanı sıra komşu normal glandüler epitel gözden geçirin. Not: Bir kurul onaylı patolog H &amp; E lekeli slaytlar ve ma gözden geçirmelidirtümör ve normal bir alanlar için rk. MiRNA için ileriki bölümlerde kılavuzları, normal alanlar vs tümör analizleri olarak işaretlenmiş slaytlar kullanın. </li></ol> Kantitatif Gerçek zamanlı PCR ile 2. miRNA İfade Analizi Not: Lazer Yakalama mikrodiseksiyon, (miRNA ve mRNA dahil) toplam RNA izolasyonu, aşağıdaki bölümlerde ayrıntılı olarak TaqMan MicroRNA ifade tahlilleri kullanılarak olgun miRNA&#39;lar denenmesi: Bu iş akışı aşağıdaki adımları içerir. <ol><li> RNA Ekstraksiyonu <ol><li> Prostat Kanseri FFPE Dokular miRNA İzolasyonu <ol><li> Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) Not: adımları gerçekleştirin 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 kimyasal davlumbaz. <ol><li> LCM doku slaytlar (10 mikron kesitler) hazırlayın. 10 dakika her biri için, (2x) Ksilen ıslatılarak Deparrafinize doku bölümleri, daha sonra damıtılmış ve ardından kademeli etanol (100,% 95,% 90,% 80,% 70%) her 5 dakika boyunca inkübe slaytlar dokuları rehidrasyonu su(5 dakika). </li><li> Rehidrasyondan sonra, 30 saniye için hematoksilin ile leke bölümler su eklendi. </li><li> Talep dereceli etanol dokular (70,% 95,% 90,% 80,% 70%) (her biri 5 dakika) ve ksilenden (5 dakika). </li><li> Daha sonra kuru bir davlumbaz slaytlar ve mikrodiseksiyon LCM enstrüman yerleştirin. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak 24 ile LCM Sistemi ile microdissections gerçekleştirin. Kullanım patolog prostat kanseri odaklarının belirlenmesi yanı sıra komşu normal dokuya için rehber olarak slaytlar işaretlenmiş. 70-90 mW bir gücü olan bir 10-20 mikron çaplı darbe lazer ışını kullanarak. </li><li> LCM kapaklar üzerine kızılötesi lazer darbeleri ile ilgi Yakalama alanları. Numune başına miRNA çıkarılması için 2-5 kapaklar hücreleri birleştirin. Hemen çıkarılan RNA bütünlüğünü sağlamak miRNA çıkarılması için yakalanan hücreleri işlemek için. </li><li> Seçenek olarak ise, MiRNA ekstraksiyon tampon içinde lize hücreleri (üreticinin protokolüne göre) ve sto-80 ºC lizatlarında yeniden. </li></ol></li><li> LCM microdissected Dokular miRNA Ekstraksiyon ve Analizleri <ol><li> Üreticinin talimatlarına göre bir ticari kit kullanılarak microdissected FFPE dokulardan toplam RNA ekstrakte edin. Not: lazer yakalama miscrodissection RNA verimi tipik olarak düşüktür. Bu nedenle, RNA düşük ses (20-30 ul) içine akıtılan ve üreticinin talimatlarına Taqman mikroRNA ifade analizleri kullanılarak ifade profilleme (ayrıca bölüm 2.2 anlatılmıştır) için kullanılır. Olgun miRNA&#39;ların gerçek zamanlı PCR tespiti için, giriş RNA optimizasyonu elüte RNA 5 ul, her MiRNA özgü ters transkripsiyon reaksiyonu için uygun olduğunu göstermektedir. Endojen bir kontrol olarak, RNU48 / RNU24 kullanılır. Kontrol reaksiyonları için, elüt RNA&#39;nın 2 ul ters transkripsiyon reaksiyonu için kullanılır. </li></ol></li></ol></li><li> Prostat Kanseri Frozen Dokular miRNA İzolasyonu <ol><li> Homojen birbir havan ve havan tokmağı kullanarak sıvı azotun içinde donmuş dokular öğütülmesiyle rezeke prostat dokuları çer-. Soğutulmuş spatula kullanarak bir mikrosantrifüj tüp homojenize doku aktarın. Kolaylıkla transfer edilebilir, böylece sıvı azot Homojenize doku daldırılmak suretiyle aynı sıcaklıkta harç / havan tokmağı ve bir spatula koruyun. </li><li> Homojenize doku ticari guanidin izotiyosiyanat-fenol reaktifı (doku 1 ml / 0.1 g) ilave edilir ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Not: Ticari guanidin izotiyosiyanat-fenol reaktifı içinde homojenleştirilen dokulara birkaç ay boyunca -80 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Homojenat (0.2 ml kloroform / ml) kloroform ilave edin ve 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır. 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de santrifüj, ardından 3-5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Taze, steril RNaz içermeyen 1.5 ml tüp üst sulu faz transfer. </li><li> Izopropil alkol eşit hacim. Mix ve 10 mil boyunca inküben, oda sıcaklığında RNA topak haline 4 ° C &#39;de 20 dakika boyunca 12,000 x g&#39;de santrifüj ile izledi. </li><li> Süpernatant aspire ve% 70 etanol içinde 1 mL RNA pelet yıkayın. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 12.000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle süpernatant aspire. 5-10 dakika boyunca oda sıcaklığında kuru bir RNA peletleri. 50-100 ul nükleaz içermeyen su içinde RNA eritin. </li><li> NanoDrop spektrofotometre kullanılarak RNA miktarının gerçekleştirin ve bir Bioanalyzer RNA bütünlüğünü belirler. 10 ng / ul RNA konsantrasyonları ayarlayın. PCR analizleri gerçek zaman (Bölüm 2.2) ve ardından miRNA- özel cDNA reaksiyonu için 10-50 ng RNA kullanın. </li></ol></li></ol></li><li> MiRNA İfade Analizi için Kantitatif Real-time PCR Aşağıda tarif edildiği gibi iki aşamalı bir RT-PCR protokol kullanılarak, olgun Deneyi miRNA&#39;ların: edin. <ol><li> Ters Transkripsiyon (RT) <ol><li> Arka üreticinin talimatlarına uygun olarak, ters transkripsiyon MiRNA kiti kullanılarak RNA&#39;dan cDNA transkribe.MicroRNA Tahliller ve RT kiti miRNA belirli primer ile toplam RNA 10-50 ng kullanın. Kontrol olarak RNU48 / RNU24 / RNU6B kullanın. (Analiz miRNA&#39;nın bolluğuna bağlı olarak) ila 1:10 5 ve bir sonraki aşamada tarif edildiği gibi gerçek zamanlı PCR algılama kullanımı: cDNA 1 seyreltin. </li></ol></li><li> Olgun miRNA Tespiti için Real-time PCR <ol><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak, hızlı Evrensel ana karışımı ile mikroRNA tahlilleri kullanılarak, cDNA örnekleri PCR ürünleri yükseltin. RNU48 / RNU24 / RNU6B kontrol örnekleri normalize. Hızlı Real Time PCR Sistemi gen ifadesinde göreli değişiklikleri hesaplamak için karşılaştırmalı Ct (eşik döngüsü) yöntemini kullanın. Üçlü olarak her numune analiz edin. </li></ol></li></ol></li></ol> Yerinde Hibridizasyon tarafından 3. miRNA Anlatım Analizleri (ISH) <ol><li> Dokuların Ön Arıtma <ol><li> Bir mikrotom kullanılarak FFPE prostat kanseri dokusu bloklarından 5 mikron bölümleri kesin. </li><li&gt; 1 saat 56 ° C&#39;de slaytlar kuluçka doku bölümleri sabitleyin. Not: MiRNA analizleri Slaytlar birkaç hafta oda sıcaklığında saklanabilir. </li><li> 15 dakika her biri için, (2x), ksilen ile slaytlar ıslatılmasıyla dokuları Deparrafinize. </li><li> Damıtılmış su (5 dakika), ardından aşamalı etanol (100% (2x),% 95,% 90,% 80,% 70) &#39;de 5 dakika süre ile, her slaytlar inkübe edilerek dokuları rehidrate. </li><li> 20 dakika için oda sıcaklığında PBS içinde% 4 paraformaldehit ile slaytlar sabitleyin. </li><li> 5 dakika her biri için oda sıcaklığında PBS (2x) ile slaytlar yıkayın. </li><li> Önceden ısıtılmış Proteinaz K tamponu içinde 10 dakika (5 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM EDTA, 1 mM NaCl), 37 ° C&#39;de 10 ug / ml proteinaz K ile slaytlar tedavi edin. </li><li> Proteinaz-K işlendikten sonra 30 saniye süreyle PBS içinde% 0.2 glisin ile slaytlar yıkayın. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında PBS (1x) slaytlar yıkayın. </li><li> 15 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehit ile slaytlar sabitleyin. </li><li> Ile durulayın slaytlar5 dakika boyunca PBS ile yıkandı. </li></ol></li><li> Melezleme <ol><li> Nemli bir oda içinde 55 ° C &#39;de 3-4 saat için önceden hibridizasyon solüsyonu ile slaytlar önceden hibridize. Odacık nemlendirilmelidir tutmak için% 50 formamid /% 50 5x SSC batırılmış doku laboratuvar mendil kullanın. </li><li> Hibridizasyon tamponu içinde 20-50 nM arasında bir konsantrasyonda 5 &#39;digoksigenin işaretli problar kullanarak. 4 dakika 90 ºC miRNA özgü prob (20-50 nM) ve küçük nükleer RNA U6 kontrol probu (20 nM), ısı seyreltin buz üzerine yerleştirin ve soğuk hibridizasyon tamponu buz ekleyin (2-4 ng / ml ). </li><li> Prob özgü hibridizasyon sıcaklığında 12-16 saat süreyle inkübe hibridizasyon solüsyonu (prob + hibridizasyon tamponu, slayt başına 100 ul) ekleyin öncesi hibridizasyon çözüm çıkarın (Hibridizasyon sıcaklığı = Tm probu-21 ºC). Nemli bir bölmede (% 50 formamid /% 50 5x SSC) &#39;de melezleşme. </li></ol></li><li> Yıkama adımları <ol><li> 45 ºC de 10 dakika boyunca 2x SSC ile slaytlar yıkayın. </li><li> Yıkama tO 45 ºC 10 dakika boyunca 1.5x SSC slaytlar. </li><li> 20 dakika her biri için 37 ° C&#39;de 0.2x SSC (2x) ile slaytlar yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca 1 x bloke edici bir solüsyonuyla slaytlar inkübe </li></ol></li><li> Algılama <ol><li> 1 ile slaytlar inkübe: 100 PBS 1-4 saat boyunca veya bütün gece 4 ° C&#39;de AP-konjuge anti-digoksigenin antikor seyreltilmiştir. </li><li> 10 dakika her biri için, oda sıcaklığında PBS (3x) ile slaytlar yıkayın. </li><li> 5 dakika her biri oda sıcaklığında Alkalin Fosfataz tamponu (100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCI,% 0.1 Tween-20) ile slaytlar (2x) yıkanır. </li><li> 1-20 saat boyunca oda sıcaklığında karanlıkta BM Mor AP alt-tabaka slaytlar inkübe edin. </li><li> PBS su içinde% 0.1 Tween-20 ve yıkama (2x) içeren slaytlar durulayın. </li><li> Sulu montaj medyayı kullanarak slaytları monte edin ve bir mikroskop altında incelemek. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics.">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).</li><li>Shen, M. M., Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+prostate+cancer:+new+prospects+for+old+challenges.">Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges.</a> Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).</li><li>Sequeiros, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+markers+for+prostate+cancer+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues.">Molecular markers for prostate cancer in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Biomed Res Int. 2013, 283635 (2013).</li><li>Cary, K. C., Cooperberg, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+in+prostate+cancer+surveillance+and+screening:+past,+present,+and+future.">Biomarkers in prostate cancer surveillance and screening: past, present, and future.</a> Ther Adv Urol. 5 (6), 318-329 (2013).</li><li>Sartori, D. A., Chan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+in+prostate+cancer:+what's+new.">Biomarkers in prostate cancer: what's new.</a> Curr Opin Oncol. 26 (3), 259-264 (2014).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).</li><li>Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mammalian+microRNA+host+genes+and+transcription+units.">Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units.</a> Genome Res. 14 (10A), 1902-1910 (2004).</li><li>Borchert, G. M., Lanier, W., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+III+transcribes+human+microRNAs.">RNA polymerase III transcribes human microRNAs.</a> Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1097-1101 (2006).</li><li>Cai, X., Hagedorn, C. H., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microRNAs+are+processed+from+capped,+polyadenylated+transcripts+that+can+also+function+as+mRNAs.">Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs.</a> RNA. 10 (12), 1957-1966 (2004).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+genes+are+transcribed+by+RNA+polymerase+II.">MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II.</a> EMBO J. 23 (20), 4051-4060 (2004).</li><li>Bartel, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+target+recognition+and+regulatory+functions.">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136 (2), 215-233 (2009).</li><li>Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+prostate+cancer:+from+biomarkers+to+molecularly-based+therapeutics.">MicroRNAs in prostate cancer: from biomarkers to molecularly-based therapeutics.</a> Prostate Cancer Prostatic Dis. 15 (4), 314-319 (2012).</li><li>Hurst, D. R., Edmonds, M. D., Welch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastamir:+the+field+of+metastasis-regulatory+microRNA+is+spreading.">Metastamir: the field of metastasis-regulatory microRNA is spreading.</a> Cancer Res. 69 (19), 7495-7498 (2009).</li><li>Saini, S., Majid, S., Dahiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet,+microRNAs+and+prostate+cancer.">Diet, microRNAs and prostate cancer.</a> Pharm Res. 27 (6), 1014-1026 (2010).</li><li>Saini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+Role+of+mir-203+in+Prostate+Cancer+Progression+and+Metastasis.">Regulatory Role of mir-203 in Prostate Cancer Progression and Metastasis.</a> Clin Cancer Res. 17 (16), 5287-5298 (2011).</li><li>Ambs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+profiling+of+microRNA+and+messenger+RNA+reveals+deregulated+microRNA+expression+in+prostate+cancer.">Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer.</a> Cancer Res. 68 (15), 6162-6170 (2008).</li><li>Martens-Uzunova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+and+prognostic+signatures+from+the+small+non-coding+RNA+transcriptome+in+prostate+cancer.">Diagnostic and prognostic signatures from the small non-coding RNA transcriptome in prostate cancer.</a> Oncogene. 31 (8), 978-991 (2012).</li><li>Porkka, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiling+in+prostate+cancer.">MicroRNA expression profiling in prostate cancer.</a> Cancer Res. 67 (13), 6130-6135 (2007).</li><li>Schaefer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+and+prognostic+implications+of+microRNA+profiling+in+prostate+carcinoma.">Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma.</a> Int J Cancer. 126 (5), 1166-1176 (2010).</li><li>Maugeri-Sacca, M., Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+microRNAs+in+prostate+cancer+and+therapeutic+opportunities.">Functional role of microRNAs in prostate cancer and therapeutic opportunities.</a> Crit Rev Oncog. 18 (4), 303-315 (2013).</li><li>Xi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+microRNA+expression+of+RNA+extracted+from+fresh+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+samples.">Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples.</a> RNA. 13 (10), 1668-1674 (2007).</li><li>Lucas, S. M., Heath, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+challenges+in+development+of+differentially+expressed+and+prognostic+prostate+cancer+biomarkers.">Current challenges in development of differentially expressed and prognostic prostate cancer biomarkers.</a> Prostate Cancer. , 640968 (2012).</li><li>Singh, S. K., Kumar, R., Wengel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Novel+Bicyclo[2.2.1]+Ribonucleosides:+2'-Amino-+and+2'-Thio-LNA+Monomeric+Nucleosides.">Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2'-Amino- and 2'-Thio-LNA Monomeric Nucleosides.</a> J Org Chem. 63 (18), 6078-6079 (1998).</li><li>Suh, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-145+is+regulated+by+DNA+methylation+and+p53+gene+mutation+in+prostate+cancer.">MicroRNA-145 is regulated by DNA methylation and p53 gene mutation in prostate cancer.</a> Carcinogenesis. 32 (5), 772-778 (2011).</li><li>Shukla, C. J., Pennington, C. J., Riddick, A. C., Sethia, K. K., Ball, R. Y., Edwards, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection+in+prostate+cancer+research:+establishment+and+validation+of+a+powerful+tool+for+the+assessment+of+tumour-stroma+interactions.">Laser-capture microdissection in prostate cancer research: establishment and validation of a powerful tool for the assessment of tumour-stroma interactions.</a> BJU Int. 101 (6), 765-774 (2008).</li><li>Nelson, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAKE+and+LNA-ISH+reveal+microRNA+expression+and+localization+in+archival+human+brain.">RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain.</a> RNA. 12 (2), 187-191 (2006).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR.">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).</li><li>Hanna, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+microRNAs+in+tissue+microarrays+by+in+situ+hybridization.">Quantitative analysis of microRNAs in tissue microarrays by in situ hybridization.</a> Biotechniques. 52 (4), 235-245 (2012).</li></ol>

The authors have no financial disclosures.

Bu yazıda, arşivlenmiş FFPE veya taze donmuş prostat kanseri, klinik dokularda profilleme miRNA ifade basitleştirilmiş iş akışını açıklar. Prostat kanserinde, çeşitli çalışmalar prostat kanseri başlatılması, ilerlemesinde ve metastazında microRNA önemli bir rol oynadığını düşündürmektedir. Ancak, çelişkili sonuçlar genellikle miRNA çıkarma beri belirli bir miRNA 22 üzerinde elde edilen ve yöntemler çok farklıdır analizlerin. Prostat kanseri prognoz, teşhis ve tedavi i...

Prostat bezi kanseri erkekler arasında kanserle ilişkili ölümlerin önde gelen nedenlerinden biri olan yaygın tanı erkek kanseridir. ABD&#39;de, bir 220.800 yeni vaka tahmin ve 27540 ölüm 2015 1 rapor edilecektir. Prostat kanseri tümörleri tembel ya da çok agresif olabilir ders-derece değişken hastalığı olan heterojen bir hastalıktır. Prostat kanseri, klinik yönetiminde kritik bir meydan okuma hastalığı taraması, tanısı, prognozu ve tedavisi 2 şu anda kullanılan yöntemler / biyomarkerların yetersizliği ile ortaya atılır. Güncel tarama yöntemleri prostat spesifik antijen (PSA) testi ve prostat biyopsisi 3 tarafından izlenen bir parmakla rektal muayene (PRM) içerir. Prostat spesifik antijen (PSA) anlamlı klinik yönetimi ve sağkalım oranları 4 devrim yarattı en yaygın kullanılan prostat kanseri biyomarkerdir. Ancak, PSA dahil lac doğasında sınırlamalarözgünlüğü, PSA bazlı tarama k tanı üzerinde ve hastalığın tedavisi üzerinde yol açmıştır. Bu bakışa göre, yoğun çabalar, alternatif prostat kanseri biyomarkerların için bir arama doğru hastalığın saldırganlık tahmin ve daha iyi tedavi kararları 4,5 sürebilirsin hangi özellikle yöneltiliyor. Son birkaç yıldır, mikroRNAlar (miRNA&#39;lar) umut verici alternatif prostat kanseri biyomarkerler olarak ortaya çıkmıştır. MikroRNA&#39;lar (miRNA&#39;ların) aynı kökenli mRNA hedef 3&#39;- çevrilmemiş bölgelerin (UTRs) ile sekansa özel etkileşimler yoluyla post-transkripsiyonel gen ekspresyonunu bastırmak küçük kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar evrimsel olarak muhafaza edilmiş sınıfını teşkil ederler. Bu mRNA% 60 miRNA&#39;ların 6 hedeflerini muhafaza edilir&gt; olduğu tahmin edilmektedir. miRNA genlerinin intergenik bölgelerde veya intronlar veya genleri 7 kodlama protein / non-protein ekson içinde yer almaktadır. Bu genler tercihen prima içine RNA Polimeraz II transkripsiyonury miRNA&#39;lar (pri-miRNA&#39;lar, birkaç kilobaz uzunluğunda) Bu biçim firkete şeklinde kök halka ikincil yapılar. Bu pri-miRNA&#39;lar sitoplazmaya ihraç ve ayrıca 8-10 (18-25 nükleotid uzunluğunda) olgun miRNA&#39;lar içine işlenir haberci miRNA&#39;lar (60-75 nükleotid uzunluğunda öncesi miRNA&#39;lar) içine işlenir. miRNA&#39;lar çoğalması, geliştirme, farklılaştırma ve apoptoz 11 gibi önemli hücresel süreçleri düzenler. Çalışmalar prostat kanseri 12-15 olmak üzere çeşitli insan malignlerinde miRNA ifade profillerinin yaygın düzensizliği öneririz. MiRNA sentezleme profilleri yaygın primer ve metastatik prostat kanserinde düzensiz için rapor edilmiştir. Altered miRNA ifade miRNA&#39;ların 12,14,16-19 prognostik potansiyelini vurgulayarak prostat kanseri ilerlemesi, saldırganlık ve nüks ile bağlantılı olmuştur. Artan miktarda kanıt vücut miRNA&#39;lar prostat kanseri başlangıcı, gelişimi, ilerleme önemli mekanik rol oynarlar olduğunu gösteririyonu ve metastazı. Genel olarak, miRNA&#39;lar prostat tümörlerinin 12 tabakalaşma normal ve kanserli dokuların ve yardım ayırt edebilirsiniz prostat kanseri tanı ve prognoz gibi umut verici alternatif biyobelirteçleri ortaya çıkmaktadır. Ayrıca, miRNA&#39;ların prostat kanseri 20 karşı etkili terapötik maddelerin geliştirilmesi için önemli hedeflerdir. Endojen RNaz etkinliğinin kendi küçük boyutu ve direnci nedeniyle, hali hazırda miRNA&#39;ların formalinle sabitlenmiş dokular 21 ve prostat biyopsisi 22 tespit edilebilir stabil biyolojik belirteçler. Ayrıca, miRNA&#39;ların ekspresyon profilleri, sabit dondurulmuş ve formalin dokularda karşılaştırılmış ve güçlü bir biçimde 21 korelasyon olduğu tespit edilmiştir. Ancak, prostat kanseri, klinik dokularda profilleme miRNA ifade genellikle vb prostat kanseri ağır dinleri etkili biyomarkırların olarak miRNA&#39;lar gelişmesi tümör heterojenliği, örnekleme hataları, stromal kirlenme nedeniyle zorluKlinik dokularda onların doğru algılama es. Burada arşivlenmiş FFPE veya taze donmuş prostat kanseri, klinik örneklerde profilleme miRNA ifade laboratuarımızda kullanılan basitleştirilmiş iş akışını açıklar. Biz kantitatif gerçek zamanlı PCR bir arada istihdam ve miRNA için in situ hibridizasyon eski verimli daha nicel bilgi ve dokuların bir dizi potansiyel miRNA biyomarkerlerin diferansiyel ifadesi görselleştirmek için ikincisi ile, klinik örneklerin analizleri. Bu iş akışı içinde, FFPE ve dondurulmuş prostat dokulardan MiRNA çıkarılması için mevcut olan yöntemleri optimize ekspresyon problar 23 tabanlı kilitli nükleik asit (LNA) kullanılarak MiRNA RT-PCR ve miRNA in situ hibridizasyon tekniği göre Taqman probu ile incelenmiştir. LNA tabanlı sondalar DNA- ya da RNA bazlı prob ile karşılaştırıldığında artan duyarlılık ve özgüllük sunmak ve onların GC içeriği ne olursa olsun, tüm miRNA dizilerinin sağlam algılama sağlar ve aynı zamanda ayrımcılığın izinmiRNA ailelerin yon. Bizim optimize miRNA ISH protokol miRNA biyomarker keşfini hızlandırmak için potansiyeli sunan ikincisi ile, prostat kanseri dokusu slaytlar veya prostat kanseri dokusu mikrodizileri (TMA) tatbik edilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems&#160;</td>
			<td>RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arcturus Autopix for LCM</td>
			<td>Arcturus/ Life Technologies</td>
			<td>LCM1621/LCM1110</td>
			<td>Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CapSure Macro LCM Caps</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LCM0211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy FFPE Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">217504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Fast Real Time PCR System&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td>
			<td align="right">4351106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td>
			<td align="right">4366596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Fast Universal PCR master mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td>
			<td align="right">4352042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG labeled LNA probe for U6</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>99002-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BM Purple AP substrate</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">11442074001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-hybridization solution&#160;</td>
			<td>Biochain</td>
			<td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-1</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization solution&#160;</td>
			<td>Biochain</td>
			<td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-2</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution&#160;</td>
			<td>Biochain</td>
			<td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-8</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP-conjugated anti-digoxigenin antibody</td>
			<td>Biochain</td>
			<td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-7</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting media&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>H-5501&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15596018">15596-018</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris hematoxylin</td>
			<td>Statlab</td>
			<td>SL200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin&#160;</td>
			<td>Statlab</td>
			<td>SL201&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mirna expression analyses in prostate cancer clinical tissues

Prostat kanseri (PCa) klinik yönetiminde kritik bir meydan okuma hastalığı taraması, tanısı, prognozu ve tedavisi için günümüzde kullanılan biyolojik belirteçlerin yetersizliği ile ortaya atılır. Son yıllarda, mikroRNAlar (miRNA&#39;lar) prostat kanseri tanı ve prognoz gibi umut verici alternatif biyomarkerları ortaya çıkmıştır. Ancak, prostat kanseri için etkili biyomarkırların olarak miRNA&#39;lar gelişimi ağır klinik dokularda onların doğru algılama dayanır. miRNA genellikle tümör heterojenite, örnekleme hataları, stromal kirlenme vb miRNA bir arada kullanarak arşivlenmiş FFPE veya taze donmuş prostat kanseri, klinik örneklerin analizleri için bu makalenin amacı basitleştirilmiş iş akışı tanımlamaktır nedeniyle zorlu prostat kanseri klinik örneklerin analizleri kantitatif gerçek zamanlı PCR (RT-PCR) ve in situ hibridizasyon (ISH). Bu iş akışı içinde, biz FFPE gelen miRNA çıkarılması için mevcut metodolojiler ve dondurulmuş prostat tissu optimizees ve ifade miRNA RT-PCR tabanlı Taqman-prob ile analiz eder. Dayanan problar - Ayrıca, ISH için optimize edilmiş bir yöntem, kilitli nükleik asit (LNA) kullanılarak prostat dokularında formiRNA algılama analiz tarif eder. Bizim optimize miRNA ISH protokol prostat kanseri dokusu slaytlar veya prostat kanseri dokusu mikrodizileri (TMA) tatbik edilebilir.

RT-PCR ile LCM birincil prostat kanseri, klinik örneklerde miR-203 İfade profil analizleri (Şekil 1) RT-PCR LCM primer prostat kanseri dokularında göre miR-203 ekspresyonunun analiz eder ve bir kontrol olarak kullanılmıştır Saini ve ark., 15 RNU48 tarif edildiği gibi eşleştirilir, bitişik normal bölgeler gerçekleştirilmiştir. Aşağıdaki tablo, komşu normal dokulara göre prostat kanseri tümör dokularında göre miR-203 ekspresyonunu ...

Watch this Scientific Journal Video about miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues at JoVE.com

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

Prostat Kanseri Klinik Dokularındaki miRNA İfade Analizleri

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

mirna-expression-analyses-in-prostate-cancer-clinical-tissues

Research

JoVE Journal

Medicine

10.8K Görüntüleme.  University of California San Francisco. Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

Video: miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Intravital Görüntüleme Gerçek Zamanlı tümörler Nanopartikül Alımı Değerlendirme

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Tıp

Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis

Cancer development is a multiple-step process involving many cell types including cancer precursor cells, immune cells, fibroblasts and endothelial cells. Each type of cells undergoes signaling and functional changes during carcinogenesis. The current challenge for many cancer researchers is to dissect these changes in each cell type during the multiple-step process in vivo. In the last few years, the authors have developed a set of procedures to isolate different cell populations during skin cancer development using K14creER/R26-SmoM2YFP mice. The procedure is divided into 6 parts: 1) generating appropriate mice for the study (K14creER+ and R26-SmoM2YFP+ mice in this protocol); 2) inducing SmoM2YFP expression in mouse skin; 3) preparing mouse skin biopsies; 4) isolating epidermis from skin; 5) preparing single cells from epidermis; 6) labeling single cell populations for flow cytometry analysis. Generation of sufficient number of mice with the right genotype is the limiting step in this protocol, which may take up to two months. The rest of steps take a few hours to a few days. Within this protocol, we also include a section for troubleshooting. Although we focus on skin cancer, this protocol may be modified to apply for other animal models of human diseases.

Carcinogenesis is a process involving interactions between cancer cells and the cancer microenvironment. To dissect the molecular events, one needs to isolate different cell populations at different stages during cancer development. Using a mouse model for basal cell carcinoma, we describe a protocol for cell analyses during carcinogenesis.

Hücre Nüfus Analizler Cilt Karsinojenez sırasında

Cancer development is  a multiple-step process involving many cell types including cancer precursor  cells, immune cells, fibroblasts and endothelial ...

MR Molecular Imaging of Prostate Cancer with a Small Molecular CLT1 Peptide Targeted Contrast Agent

Tumor extracellular matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers for cancer molecular imaging. In this work, we demonstrated effective MR cancer molecular imaging with a small molecular peptide targeted Gd-DOTA monoamide complex as a targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma. We performed the experiment of evaluating the effectiveness of the agent for non-invasive detection of prostate tumor with MRI in a mouse orthotopic PC-3 prostate cancer model. The targeted contrast agent was effective to produce significant tumor contrast enhancement at a low dose of 0.03 mmol Gd/kg. The peptide targeted MRI contrast agent is promising for MR molecular imaging of prostate tumor.

To demonstrate MR cancer molecular imaging with a small peptide targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma in a mouse prostate cancer model.

Küçük Moleküler CLT1 Peptide Hedefli Kontrast Agent ile Prostat Kanseri MR Moleküler Görüntüleme

Tumor extracellular  matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers  for cancer molecular imaging. In this work,  we ...

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, particularly in low dosage values1&#8203;&#8203;. &#8216;How to use PSA&#39; remains a current issue, either for diagnosis as a gray zone corresponding to a concentration in serum of 2.5-10 ng/ml which does not allow a clear differentiation to be made between cancer and noncancer2 or for patient follow-up as analysis of post-operative PSA kinetic parameters can pose considerable challenges for their practical application3,4. Alternatively, noncoding RNAs (ncRNAs) are emerging as key molecules in human cancer, with the potential to serve as novel markers of disease, e.g. PCA3 in prostate cancer5,6 and to reveal uncharacterized aspects of tumor biology. Moreover, data from the ENCODE project published in 2012 showed that different RNA types cover about 62% of the genome. It also appears that the amount of transcriptional regulatory motifs is at least 4.5x higher than the one corresponding to protein-coding exons. Thus, long terminal repeats (LTRs) of human endogenous retroviruses (HERVs) constitute a wide range of putative/candidate transcriptional regulatory sequences, as it is their primary function in infectious retroviruses. HERVs, which are spread throughout the human genome, originate from ancestral and independent infections within the germ line, followed by copy-paste propagation processes and leading to multicopy families occupying 8% of the human genome (note that exons span 2% of our genome). Some HERV loci still express proteins that have been associated with several pathologies including cancer7-10. We have designed a high-density microarray, in Affymetrix format, aiming to optimally characterize individual HERV loci expression, in order to better understand whether they can be active, if they drive ncRNA transcription or modulate coding gene expression. This tool has been applied in the prostate cancer field (Figure 1).

Human endogenous retroviruses (HERV), which occupy 8% of the human genome, retain scarce coding capacities but a hundred thousand long terminal repeats (LTRs). A custom Affymetrix microarray was designed to identify individual HERV locus expression and was used on prostate cancer tissues as a proof of concept for future clinical studies.

Prostat Kanserinde Biyomarker Discovery Uygulama: Bireysel herv Lokusları İfade Mikroarray tabanlı Kimlik

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

İnsan Prostat Kanser metastaz Ortotopik fare modeli

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

İnsan Prostat Kanseri Örneklerinden Kanser Kök Hücreleri İzolasyon

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

İnsan Göğüs Kanseri dokuları ve hücre hatlarından gelen Mammosphere Oluşumu Testi

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

Prostat Kanseri Hasta Üretimi Tümör Hücreleri Sirkülasyon gelen Xenograftlarında Modeller Türetilmiş

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Translational Kanser Araştırma İnsan Doku ile Çalışma

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective tyrosine kinase inhibitors (TKIs). To optimize the use of these TKIs, the discovery of new biomarkers for early detection and disease progression is mandatory. These plasma-isolated exosomes can be used as a non-invasive and repeatable way for the detection and follow-up of these biomarkers. One ml of plasma from 12 NSCLC patients, with different mutations and treatments (and 6 healthy donors as controls), were used as exosome sources. After RNAse treatment, in order to degrade circulating miRNAs, the exosomes were isolated with a commercial kit and resuspended in specific buffers for further analysis. The exosomes were characterized by western blotting for ALIX and TSG101 and by transmission electron microscopy (TEM) analysis, the standard techniques to obtain biochemical and dimensional data of these nanovesicles. Total RNA extraction was performed with a high yield commercial kit. Due to the limited miRNA-content in exosomes, we decided to perform retro-transcription PCR using an individual assay for each selected miRNA. A panel of miRNAs (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), all correlated with NSCLC disease, were analyzed taking advantage of the remarkable sensitivity and specificity of Real-Time PCR analysis; mir-1228-3p was used as endogenous control and data were processed according to the formula 2-&#916;&#916;ct 13. Control values were used as baseline and results are shown in logarithmic scale.

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer NSCLC Patients&#039; Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

This protocol describes the feasibility to perform miRNA profiling in exosomes, released in plasma of NSCLC patients, through a commercial exosome isolation kit with Proteinase K and RNAse treatments, in order to avoid circulating miRNAs contamination and evaluate their biomarker features in NSCLC.

qPCR sayesinde küçük hücre dışı akciğer kanseri (KHDAK) Hasta Plazma içinde Exosomal miRNA Analizi: Bir Uygulanabilir Sıvı Biyopsi Aracı

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective ...