Bu protokol, uyarlanabilir bir yönetici muhabir kullanarak Birleştirme Verimliliğini İzlemek için hücresel bir Test'i açıklar. Bu muhabir Tahlil, Exxon veya splice bölgelerinde ilişkili mutasyonların etkilerini incelemek ve mutantların beş noktalı splice bölgelerine tanınmasını iyileştirmek için özellikle bir parçacık olmak üzere tedavi tasarlamak için kullanılabilir. Hela hücrelerindeki geçit harcanan ortamı aspire eder ve hücreleri üç dakika boyunca 37 santigrat derecede bir milimolar EDTA içeren üç mililitre % 0.2 5 yolculukla kuluçkaya yatırır.
Yedi mililitre taze DMEM'de inkübasyondan sonra hücre süspansiyonunu 10 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri santrifüjle. Daha sonra hücre peletini 10 mililitre taze DMEM'de yeniden biriktirin ve geçici transsfeksiyon için hücreleri% 20 izdihamda yeni bir doku kültürü çanatı üzerine plakalayın.
Hela hücrelerini temiz bir hemo sitometre kaydırağı ile sayın ve mililitre başına beşinci hücrelere 2,5 çarpı 10 yoğunlukta bir süspansiyon hazırlayın, hücre süspansiyonunun bir mililitresini 12 kuyu plakasının her kuyusuna tohumlayın ve bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkalayın. Ertesi gün harcanan ortamı aspire edin ve plakaya serumlu 800 mikrolitre taze DMEM ekleyin. Transfeksiyon karışımlarını hazırlayın ve 15 saniye boyunca Vortex edin.
Daha sonra karışımları santrifüjleyin ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya bırakın. Kuluçkadan sonra, transfeksiyon karışımının 200 mikrolitresini, kuyu başına bir mililitrelik son bir hacim elde etmek için 12 kuyu hela hücre plakasının bir kuyusuna ekleyin ve plakayı 48 saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Hazırlanan etiketleme reaksiyonları kuluçkaya yatırılıyor.
25 kilo Dalton moleküler ağırlık kesme boyutu dışlama boncuklarını 10 saniye boyunca nazik girdapla yeniden depolayın. Daha sonra, yeniden sulandırılmış boncukların 600 mikrolitresini 1,5 mililitrelik bir toplama tüpüne yerleştirilen tek kullanımlık bir mini sütuna aktarın ve boncuk stoğunu dört santigrat dereceye geri döndürün. Sütunu santrifüjle ve içlerinden akışı atın.
Daha sonra sütuna 300 mikrolitre RNA içermeyen su ekleyerek boncukları iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, mini sütunu yeni bir 1,5 mililitre santrifüj tüpüne aktarın ve kinaz reaksiyon karışımını sütuna ekleyin. Sütunu santrifüjlayın ve P32 etiketli oligonükleotidleri içeren akışı toplayın.
Heli hücrelerinden çıkarılan iki mikrogram RNA'yı 200 mikrolitre mikro santrifüj tüpüne ekleyin ve hacmi 6,55 mikrolitreye çıkarmak için RNA içermeyen su ekleyin. Daha sonra RNA örneklerini içeren her PCR tüpüne 0,9 mikrolitre bir ana karışım ekleyin ve tüpleri önce 65 santigrat derecede beş dakika, sonra bir dakika buzda kuluçkaya yatırın. Daha sonra 2.55 mikrolitrede, RNA ve master mix bir içeren her tüpe iki ana karışım yapın ve tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra tüpleri bir termal çevrime aktarın ve önce 50 santigrat derecede 60 dakika, daha sonra 70 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın. İnkübasyondan sonra, her numuneye 10 mikrolitre 2X formamid RNA yükleme boyası ekleyin ve parçaları UIA sayfasına ayırmaya devam edin. Percy DNA sentezi.
Transkine edilmiş hela hücrelerinden çıkarılan iki mikrogram RNA'yı 200 mikrolitre mikroncentrifuge tüpüne ekleyin ve hacmi düşük 11 mikrolitreye uydurmak için RNA'lar içermeyen su ekleyin. Daha sonra, iki mikrolitre ekleyin, her numuneye bir ana karışım ekleyin ve önce 65 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatırın, sonra bir dakika buzda. Daha sonra, yedi mikrolitre ekleyin, her tüpe iki ana karışım yapın ve tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya bırakın, ardından 50 santigrat derecede 60 dakika ve 70 santigrat derecede 15 dakika kuluçka yapın.
Daha sonra, PCR için C DNA reaksiyonu mikroliter başına 100 nanogram konsantrasyon elde etmek için seyreltin ve her CDNA örneğinin bir mikroliterini yeni PCR tüplerine aktarın. CDNA içeren her tüpe 10,5 mikrolitre ana karışım ekleyin ve PCR'yi gerçekleştirin. PCR tamamlandıktan sonra termosikleyici kullanma.
Her tüpe 12,5 mikrolitre 2X formamid DNA yükleme boyası ekleyin. Numuneleri 95 santigrat derecede beş dakika ısıtın ve bir UIA sayfası gerçekleştirmeye devam edin. Pipet 96-well qpcr plaka triplikat bireysel Wells içine seyreltilmiş CDNA beş mikrolitre.
Daha sonra her kuyuya 10 mikrolitre gerçek zamanlı PCR karışımı ekleyin, plakaları bir optik filmle kapatın ve Kuyuların dibine tepkileri toplamak için santrifüjleyin, ardından hedef amplicon'un eşik nicelik döngüsü değerlerini toplarken qpcr'ı gerçekleştirin. İşaretleyicileri ve numuneleri yüklemeden önce, yerleşik üreyi çıkarmak için Wells'i TBE tamponu ile boşaltın. Daha sonra her numuneden kuyu başına 10 mikrolitre yükleyin ve jeli iki ila üç saat boyunca veya ksilen dibe ulaşana kadar 300 ila 500 voltta çalıştırın.
Elektroforezikten sonra cam plakaları elektroforez aparatından çıkarın ve jelin her iki cam yüzeye düz bir şekilde uzanması için iki plakayı dikkatlice ayırın, ardından jeli bir filtre kağıdına aktarın ve bir jel kurutucu vakum kullanarak plastik bir sargı ile örtün, jeli 80 santigrat derecede 30 dakika kurutun, daha sonra kurutulmuş jeli oda sıcaklığında gece boyunca inkübasyon için bir fosfor görüntüleme kasetine yerleştirin. Hela hücrelerinde ifade edildiğinde, dilimleme muhabiri dup 51 minnijean, Exxon iki'nin verimli bir şekilde bir eklendiğini olgun tam uzunlukta transkriptini ifade eder. Beş prime splice bölgesi mutasyonu ve dup 51 P, Exxon iki dahil etmeyi% 95'ten% 30'a düşürür ve daha kısa bir transkript oluşumuna yol sağlar.
Dup 51 P'nin U15A SNRNA ile birlikte ifade edilerek Exxon iki birleştirme kurtarılır ve tam uzunlukta transkriptin oluşumunu geri yükler. Buna karşılık, U1 veya U15G varyantı türüne sahip ortak ifade dup 51P birleştirme üzerinde benzer bir etkiye sahip değildir. U15A varyant transkriptlerinin tespiti, birincil uzantıya göre U1 yedi ila 26 oligo nükleotid kullanır, bu da U1 SNRNA'nın beşinci pozisyonunda adenin yakınında 20 nükleotid uzunluğunda ve baz çifttir.
Sadece DATP varlığında, U1 yedi ila 26, 22 veya 23 nükleotid uzunluğunda bir ürün veren endojen vahşi tip U1 SNRNA için iki ila üç nükleotid içermesine izin verir. U15A ve U15G varyantları için uzantı, 21 nükleotid ürünü üreten tek bir adenozin ekledikten sonra sona erer. U2 SNRNA ekspresyona normale döndükten sonra, transfected U1 vahşi tip U1 5g ve U15A varyantları endojen SNRNA üzerinde üç ila beş kat olarak ifade edildi.
Çıkarılan RNA'nın kalitesi birleştirme analizi için kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, RNA içermeyen suyun kullanılması ve RNA'larla hizmetlerin dekontaminasyonu ajanları devre dışı bırakma şiddetle tavsiye edilir. Burada açıklanan rapor sistemi, U1SN RNA'larını modifiye ederek gen susturma için flaş fiyat birleştirme mutasyonlarının etkisini tersine çevirmek için U1 SN RNA'larının birleştirme yönetmeliklerindeki rolünü incelemek için uygulanabilir.
